士鋒生物轉基因煙草的PCR檢測

一 、材料、試劑和儀器

1 材料 基因特異引物，轉基因煙草和野生型煙草的基因組DNA，含目的基因得質粒
2 試劑 PCR Kit
3 儀器 PCR儀（PE2400），電泳儀，紫外照相裝置

二、 操作程序

1. 在滅菌1.5mL管中25μl滅菌ddH2O,，加入100ng-1μg轉基因煙草和野生型煙草的基因組DNA中，沸水浴5-10min。取出立即置于冰上，使基因組DNA變性充分。

2．在一滅菌的0.2mL小離心管中依次加入(總體積為25 ul)：
10×buffer 2.5μl
4×dNTPs （每種2.5mM ） 2.0μl
primer I (10pmol/μl) 0.5μl
primer II(10pmol/μl) 0.5μl
Template 19μl
Taq E 0.5μl (2U)
把加樣品的EP管稍離心后，置冰上備用，待 PCR儀溫度升至94℃時，將管子插入，按Pause鍵暫停，加入Taq E 0.5μl (2U)[此為熱啟動Hot start,可以防止非特異性擴增 ]。其上機的循環條件為：94℃變性3min ，55℃退火30sec ,72℃延伸45sec ，共進行30個循環，然后72℃再延伸7min 以補平DNA末端。
3. 1%Agarose gel電泳檢測，紫外照相。
三、結果與分析
PCR產物經電泳檢測在預計的分子量處出現單一DNA條帶，但常常是一條帶有主帶的彌散帶，這在以核基因組DNA做模板是常會出現，可能的原因是：核基因組復雜度高，退火溫度低，延伸時間長，引物和模板量大等。解決的方法有：采用熱啟動（如本實驗），減少模板和引物量，提高退火溫度甚至在68℃下退火和延伸，降低退火和延伸時間，減少循環次數，改變Mg 2+濃度（1.5-8mmol/L）等。
轉基因煙草的PCR檢測
其中M: DL2000； (+)含目的基因得質粒為模板，作為陽性對照；(-) 為野生型煙草基因組DNA模板作陰性對照；1-5：為轉基因煙草基因組DNA為模板。結果表明3非轉基因煙草，而1，2，4，5為陽性轉基因煙草。特異引物擴增條帶長為750bp。