外周血和臍帶血中分離單個核細胞

基 本 方 案 FicoH-Hypaque梯度離心法分離單個核細胞

材 料

肝 素 抗 凝 血（附 錄 3 G ) 或 者 肝 素 化 的 臍 帶 血（I Oml臍 帶 血 加 入 I m l 含 250U 的P B S 為宜）

P B S

聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque) 溶液

H B S S
FBS (Hyclone)，加 熱 滅 活（56°C ， Ih) 或者不加熱均可

R P M I -I O 完全培養基

15m l 或 50m l 圓錐底的離心管
Beckman GPR GH-3.7水平轉頭離心機（或者等效設備）， 18?20℃

1.檢査肝素化的抗凝血，清除細小的血凝塊。將新鮮無血凝塊的肝素化抗凝血置于15m l 或 者 50m l 離心管中，用無菌移液管加入等量室溫的P B S 。對于濃縮白細胞樣品，其 與 P B S 以 1 : 4 比例稀釋、混勻。

2 . 傾 斜 45°角持離心管，用移液管吸取聚蔗糖-泛影 葡 胺 溶 液（每 IOml血樣/P B S 混合液加入3 ml聚蔗糖-泛影葡胺溶液），伸 入 樣 品 管 底 部 ，緩緩將聚蔗糖-泛影葡胺溶液加入血樣/P B S 混合液底部。 18?20°C ， 900 g 持 續 離 心 30 min。

3 . 用無菌移液管將含血漿和大部分血小板的最上層 棄 去（圖 8. 1.1)，用另一移液管將其下層的單個核細胞移入新的離心管。加入過量的 H B S S( 達 到 細 胞 層 3 倍 體 積 的 量）洗 細 胞 ， 1 8 ?20°C ， 400 g 離 心 lOmin，棄 上 清 。重復洗細胞以除去大部分血小板。

4 . 用 R P M I -I O 完全培養基重懸單個核細胞。 計數細 胞（附 錄 3A )，并用臺盼藍標記排除死細胞（附 錄 3 0 。

5 . 若樣品為臍帶血或嬰兒血，為了獲得純的單個核細胞，可重復聚蔗糖-泛影葡胺梯度離心以避免紅細胞及其前體的污染。

6 . 如果需要，可用流式細胞儀檢測 P B M C 純 度（單 元 4. 2)。

輔 助 方 案 貼 壁 法 去 除 單 個 核 細胞 中 的 單 核 細 胞和 巨 噬 細 胞

基本方案得到的單個核細胞中幾乎4 0 % 為單核細胞和巨噬細胞。

附 加 材 料（其他材料見基本方案，帶V 項 目 見 附 錄 1)

單 個 核 細 胞 懸 液（見基本方案）

R P M I -20，完全培養基

150c m 2斜頸組織培養瓶

1.18?20°C ， 300 g 離心單個核細胞lOmin，棄上清，室溫下用RPMI- 2 0完全培養基重懸沉淀，調整細胞濃度至2 X 10⁶個細胞/ml。將 50m l 細胞懸液移入150 cm2組織培養瓶 ，水平放置于37°C ， 5 % C0 2培養箱中孵育lh。

2.將非貼壁的淋巴細胞緩緩倒入離心管，用 37°C的 RPMI-IO完全培養基輕輕沖洗組織培養瓶，洗液也加入離心管中。

3.重復步 驟 1 和 2 。再次離心細胞，棄上清，重懸沉淀于5?IOml RPMI-IO完全培養基中。計 數 單 個 核 細 胞（附 錄 3A ) ， 并 用 臺 盼 藍 排 除 法 檢 測 細 胞 活 力（通常活細胞> 9 0 % ，附 錄 3 0 。如果需要，可以 從 組 織 培 養 瓶 中 回 收 貼 壁 細 胞（單核細胞和巨噬細胞），見 單 元 8. 5 。

4.如果需要，可用流式細胞儀檢測PBM C 純 度（單 元 4. 2 ) 。