實驗材料 ATP GTP 質粒 DNA 肌酸磷酸激酶 10%SDS 膠肌酸磷酸激酶 核酸酶 tRNAHeLaS3 細胞 TgSVA 細胞 Lx 細胞來源于表達人脊髓灰質炎病毒受體的 Ltk 細胞 NS20Y 細胞 人肝癌來源的 HepG2 細胞
試劑、試劑盒 HEPES-KOH Tris-HCl 等滲溶液 低滲溶液 10X 鹽溶液 裂解溶液 磷酸肌酸 尚鐵血紅素 亞精胺 EGTA DNaseI LiC1 沉淀溶液 TE S10 翻澤混合物 [32S]Met 電泳緩沖液L 2X 上樣緩沖液 凝膠固定液
儀器、耗材 高速離心機 Dounce 勻漿器SDS 凝膠電泳裝置
實驗步驟
―、材料與設備
(一）細胞
1)HeLaS3 細胞在含 5% 新生牛血清 (NCS) 和 0.15%NaHCO3 的 RPMI1640 培養基中于 37℃ 轉瓶培養，每天進行細胞傳代以維持細胞密度為每毫升 2?5X105 個細胞
2)TgSVA 細胞來源于表達脊髓灰質炎病毒受體的轉基因小鼠腎，用含 5% 胎牛血清和 0.15%NaHCO3 的 DMEM 培養基維持單層培養
3)Lx 細胞來源于表達人脊髓灰質炎病毒受體的 Ltk 細胞，用含 5% 胎牛血清、104mol/L 次黃嘌呤、4×10-3mol/L 氨基嘌呤，8×10-4mol/L 胸腺嘧啶脫氧核苷和 0.15%NaHCO3 的 DMEM 培養基維持單層培養
4)NS20Y 細胞 (鼠成神經細胞瘤）在含 10% 胎牛血清和 0.15%NaHCO3 的高糖 DMKM 培養基中維持培養
5) 人肝癌來源的 HepG2 細胞用含 10% 胎牛血清和 15%NaHCO3 的 DMEM 培養基培養。
(二）制備 S10 抽提物
所用試劑和水均無 RNase，耗材為一次性使用
1)lmol/LHEPES-KOH(PH7.5)，高壓滅菌，室溫保存
2)lmol/LTris-HCl(pH7.5), 高壓滅菌，室溫保存
3) 等滲溶液：35 mmol/LHEFESKOH(pH7.5)，146 mmol/LNaCl，11 mmol/L 葡萄糖。高壓滅菌，4℃ 保存
4) 低滲溶液：l0 mmol/LHEPES-KOH(pH7.5)，15 mmol/LKC1，1.5 mmol/LMgAC2，6 mmol/L 巰基乙醇,-20℃ 保存
5)10X 鹽溶液：200 mmol/LHEPESKOH(pH7.5)，1.2mol/LKC1，50 mmol/LMgAc2,6 mmol/L 疏基乙醇。-20℃ 保存
6) 裂解溶液：l0 mmol/LHEPES-KOH(pH7.5)，120 mmol/LKC1，1.5 mmol/LMgAc2，lmmol/L 二硫蘇糖醇-
7)0.2mol/L 磷酸肌酸 (CP): 磷酸肌酸溶于無 RNase 的水中，按 0.2?0.3 ml 分裝，一 20°C 保存
8)10 mg/ml 肌酸磷酸激酶 (CPK):CPK 溶于 20 mmol/LHEPES,pH7.5 和 50% 甘油溶液中，按 0.2rnl 分裝，一 20℃ 保存
9)15OOOU/ml 核酸酶：lml 無 RNase 的水中溶解 15000U(=0.667 mg) 核酸酶 S1，—20℃ 保存
10)15 mg/mltRNA: 溶解 ISmgtRNA 在 lml 水中，酚抽提數次，乙醇沉淀。再用無 RNase 的水溶解沉淀，濃度為 15 mg/ml，—20℃ 保存
11)lmmol/L 尚鐵血紅素：6.5 mg 高鐵血紅紊溶解在 0.5 ml1mol/LKOH，加 0.5 mLTris-HCl(pH7.5)，用 lmol/LHCl 調至 ph7.8，加 8.5 ml 己二醇。18000 g 離心 5 min，收集上清，一 20°C 保存
12)l00 mmol/L 亞精胺：溶解在無 RNase 的水中，一 20℃ 保存。
13)0.2mol/LEGTA: 溶解在無 RNase 的水中，用 5mol/LKOH 調整至 PH7.5 ,4℃ 保存
14)20 mmol/LATP: 溶解 122 mgATP 在 10 ml 無 RNasc 的水中，用 lmol/LNaOH調整至 pH7.0, 按 0.2?0.5 ml 分裝于—20℃ 保存
15)20 mmol/LGTP: 溶解 96 mgGTP 在 10 ml 無 RNase 的水中，用 lmol/LNaOH 調整至 pH7.0, 按 0.2?0.5 ml 分裝，一 20℃ 保存
16) 高速離心機。
17)Dounce 勻漿器。
(二）體外轉錄
1) 質粒 DNA: 包含 T7 或 T3 啟動子的質粒 DNA 和來源于脊髓灰質炎病毒或 HCV 的 IRES。
2)DNaseI: 無 RNase 的 DNaseI(2U/ul)。
3)LiC1 沉淀溶液：7.5mol/L，LiC1，50 mmol/LEDTA。
4)TE：10 mmol/LTris-HCl(pH7.6),lmmol/LEDTA
(四）體外翻譯
1)S10 翻澤混合物；4ul0.5mol/LHEPESKOH(pH7.5),26UL15mol/LKAc，0.8ulMgAc2,50ul20 mmol/LATP,2.7UL20mmol/LGTP，45ul0.2mol/LCP.2ul1mol/LDTT,2ul0.1mol/L 亞精胺，11ullmmol/L 氨基酸混合物 (無甲硫氨酸）。加無 RNase 的水至 I8Oul,30?50ul 分裝，一 80℃ 保存
2)[32S]Met:10mCi/ml 的 [32S]Met(120Ci/mmol)(翻譯級），一 80℃ 保存
3) 肌酸磷酸激酶（CPK):0.5ug/ul 的 CPK，用 10 mg/mlCPK 和無 RNase 的水新鮮配制
4)SDS 凝膠電泳裝置
5)10%SDS 膠：9.8% 丙烯酰胺，0.2% 亞甲雙丙烯酰胺，1%SDS，0.375mol/LTris-HCl(pH8.8)
6) 電泳緩沖液：3 gTris 堿，14.4 g 甘氨酸，lgSDS，加水至 1L
7)2X 上樣緩沖液：100 mmol/：LTris-HCKpH6.8),200 mmol/LDTT，4%SDS，0.2% 溴酚藍，20% 甘油
8）凝膠固定液:50% 甲醇，10%HAc 溶在水中。
二、操作方法
(-）體外翻譯抽提物的制備
1. 未感染的 HeLa 細胞
除非特殊說明，所有的步驟均須在 0?4℃ 進行。
1) 用低溫離心機于 300 g 離心 7 min, 收集大于 2L 的懸浮培養液中的 HeLa 細胞
2) 等滲溶液洗 3 次。此后步驟感染的與未感染的 HeLa 細胞一樣。
3) 在小體積等滲溶液中重懸細胞，并轉移至一帶刻度的錐形離心管中
4) 于 300 g 離心而后調整細胞密度至 2X109/7?8 ml，重懸細胞于 1.5 倍細胞體積（10 ml) 的低滲溶液中，(TC 靜置 10 min)
5) 冰冷的 Dounce 勻漿器勻漿 50 次，顯微鏡下檢査勻漿物屮細胞是否完全裂解。
6) 加 5/18 體積的 10X 鹽溶液，18000g 離心棄去沉淀沉淀包含細胞核、線粒體、膜結構樣細胞組分），上清即為粗制的 S10 抽提物
7) 加入 ATP 至終濃度為 lmmol/L, 加入 GTP 至終濃度為 0.2nnnol/L, 加入 CP 至終濃度為 8 mmol/L, 加入 CPK 至終濃度(0.2mg/ml, 于 37℃C 溫育 30 min, 以除去核糖體上結合的內源 mRNA。
8)100 倍體積的裂解溶液于 4°C 溫育 lh, 或者將抽提物過 G-25 柱以代替裂解。
9) 如果 S10 抽提物變得渾濁，于 6600 g 離心 5 min，收集乳白色上清進行以下步驟。
10) 將 0.2 mllmmol/L 高鐵血紅素，50ul10 mg/mlCPK，0,lml0.1mol/LCaCl2,0.lml15000U/ml 核酸酶 S7 于 15?20℃ 溫育 5?15 min, 以破壞內源 mRNA
11) 加入 0.lml0.2mol/LEGTA,40uL15 mg/mltRNA 將停止核酸酶反應。如果必要，于 6600 g 離心 5 min，0.2?0.3 ml 分裝凍存于-80℃
2. 脊髄灰質炎病毒感染的 HeLa 細胞
1) 收集 HeLa 細胞（5L,2X109 個細胞），懸浮在 1/20 體積（250 ml) 的無血清 RPM11640 中。
2) 感染脊髓灰質炎病毒，感染復數 MOI 為 20(4Xl010pfu）（pfu 空斑形成單位）
3) 室溫吸收 20 min，然后 37°C 溫育 40 min
4) 加 3 倍體積（750 ml) 包含 7.5%NCS 的 RPMI1640。在轉瓶中 37℃ 溫育感染細胞 4 h。以下制備 S10 的方法同未感染病毒的 Hela 細胞。
3. 感染和非感染的單層細胞
1) 用來制備 S10 抽提物的單層細胞（TgSVA、Lx、NS20Y 和 HepG2) 的生長狀態應保持良好。經 0.02mol/LEDTA 和 0.1% 胰蛋白酶消化后，從 60?100 個培養皿 (直徑 150 mm) 中收集 2X109 個細胞，懸浮在含血清的 DMEM 培養液中在轉瓶中繼續培養 5?8 h。
2) 如果要感染脊髓灰質炎病毒，加入病毒感染復數 MOI 為 20 并在懸浮培養液中培養 5 h, 吸收方法同 HeLa 細胞。
3) 感染后在懸浮培養液屮繼續培養 4 h，準備 S10 柚提物方法同 HeLa 細胞。
(二）體外 RNA 合成
1) 合適的內切酶線性化基因，酚：氯仿純化。DNA 片段不必進行分離，通過標準的體外轉朵方法制備轉錄子，或采用商品化試劑盒制備。
2)RNA 被轉錄后消化模板 DNA，加入 1U/樣品的無 RNase 的 DNaseI 于 37℃ 溫育 15 min
3) 加入 1/2 體積的 7.5mol/L LiCl，一 20℃ 放置 30 min。
4)10000 g 離心 10 min，用 80% 乙醇洗 RNA 沉淀，風干沉淀并溶于 0.5 ml 無 RNase的 TE(終濃度 1ug/ul)。通常 1ug 模板 DNA 對轉錄 5o?100ugRNA，按 10?20ul 分裝并儲存于-80℃
5) 通過瓊脂糖凝膠電泳分析 RNA 產物大小，分光光度計分析產量。
(三）無細胞翻譯
儲存于一 8O℃ 的 S10 抽提物只能凍融一次，而 11 對于每一個抽提物和每一個 mRNA，其合適的 K+,Mg2+離子濃度是不同的。
1) 將所冇的組分加至管中，最終反應包含 20ul(或 l0 ul)SlO 翻澤混合物和 RNA 模板，加無 RNase 的水至終體積 25ul(或 12.5ul)
例如，脊髓灰質炎病毒 mRNA 在 HeLaS10 屮的反應混合物：13.5ulS10,4.5ul 翻譯混合物，1ul0.5ug/uLCPK,0.1ulRNasin，0.5uCi[32S]Met, 模板 RNA(0.5ug），加無 RNasin 水至 25ul, 每個試劑的終濃度為：1.0 mmol/LATP,57umol/LGTP，9 mmol/L 酸肌酸 (CP)，0.02ug/ul 肌酸磷酸激酶 (CPK),2 mmol/LDTT，0.2 mmol/L 亞精胺，20 mmol/LHEPES,120 mmol/L(HCVmRNA 是 150 mmol/L)KAc,0,8 mmol/L(HCVmRNA 是 1.5 mmol/L)MgAc2，19 種氨基酸每種 60umol/L，0.5pCi[32S]Met 和 0.5ugRNA
2) 于 30?32°C 溫育 (通常為 60 min)，加樣品緩沖液至翻譯混合物，煮沸 2 min，10%SDS-PAGE 分析。
3) 如果必要，在曝光時可采用放射性自顯影增感屏 (autoradiographyenhancer)。
收起
注意事項
1)S10 和 S100 分別是將細胞質于 18000 g 離心和 100000 g 離心 20 minn 所獲得的上清。
2) 應采用無 RNase 的和高等級的試劑, 玻璃器皿用 2mpL/LNaOH 洗 3 次或浸泡在0.05moL/LNaOH 中過夜，然后用新鮮的去離子水完全漂洗。
3) 高鐵血紅素用來阻止 elF2α的磷酸化，應仔細調整 pH 且應無 RNaSe。
4) 自 TgSVA 細胞制備 S10 抽提物，需勻漿 80 次以上以裂解細胞。細胞勻漿物制備隨細胞類型而異。
5) 核酸酶處理會降低 S10 抽提物的活性。EGTA 和 Ca2+的濃度，溫育時間（5?l5 min) 和溫度（15?20°C) 都是非常重要的，EGTA 和 CaCl2 濃度的不合理常常是失敗的主要原因，因為游離的鈣將允許核酸酶保侍活性。
6) 生長狀態良好的細胞對于冇效制備 S10 抽提物至關重要，對于單層細胞可釆用胰酶消化，再轉至轉瓶中繼續培養 5?8 h
7) 制備有活性的 S10 抽提物成功率為 70%，從感染病毒的 HeLa 細胞中制備 S10 抽提物成功率比較高，從非感染的單層細胞制備冇翻譯活性的抽提物成功率則只有 30%?50%.
8) 在無細胞翻譯體系中，K+,Mg2+離子濃度隨抽提物和 mRNA 的種類而變。例如：在 HeLaS10 中，對于脊髓灰質炎病毒 mRNA 采用 100 mmol/LK+和 0,8 mmol/LMg2+, 而對于 HCV 病毒 mRNA 則采用 176 mmol/LK+和 1.6 mmol/LMg2+，此時合適的脊髓灰質炎病毒 mRNA 的量為 0.5ug