NA重組技術包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內容。主要用于（1）外源性基因轉染；（2）對外源性基因的轉化分離。
| 實驗方法原理 | 限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA的純化處理后用于連接反應；選擇克隆載體pUC18多克隆位點上相應的限制性內切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現外源片段的克隆。 |
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| 實驗材料 | DNA片段PUC18 |
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| 試劑、試劑盒 | R.Ebuffer水凝膠氯仿 異戊醇乙醇 |
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| 儀器、耗材 | 離心機 |
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| 實驗步驟 | 載體pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：
50 μl反應體系，用1.5ml tube，冰上操作）
DNA 30 ul
R.E 1 ul
10xbuffer 5 ul
ddH2O 14 ul
外源片段酶切產物和5 ul 37 ℃反應1hr，分別取8 ul PUC18酶切產物于1.0%凝膠檢測酶切是否完全；按2－5步純化、回收DNA
2. 加入ddH2O 150 （擴大體積），加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻，12000 g離心10 min；
3. 吸取上清，加1/10體積3 M NaAc和兩倍體積無水乙醇，-20 ℃放置15分鐘以上；
4. 12000 g 4 ℃冷凍離心15分鐘；
5. ddH2O（1.5 ml ddH2O（0.5 ml tube中），PUC18溶于20 ul 倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風干后外源DNA溶于10 tube中）；
6. 按以下反應去除載體PUC18的5'磷酸基團，50 ℃反應30 min 以上
DNA 20 ul
CIAP（TaKaRa） 0.5 ul
buffer 4.0 ′10 μl ddH2O 15.5 ul
7. 70 ℃水浴10 min, 使CIAP失活；
8. 按2－5步純化載體，溶于10 ul ddH2O；
9. 連接反應
DNA 10 ul
pUC18 2.5 ul
buffer 1.5 ′ 5 ul
mT4 ligase 3 U/ul
16 ℃水浴過夜
10. 轉化大腸桿菌感受態細胞
11. 轉化子的鑒定
收起 |
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| 注意事項 | 1. DNA重組技術包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內容。
2. 氯仿對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手套、安全鏡并在通風櫥中進行。苯酚是強腐蝕劑，能引起嚴重燒傷。操作時應戴手套、安全鏡、穿防護服，并在通風櫥中進行。 |
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| 其他 | 1. 克隆中所用到的幾種酶：（1）限制性內切酶（2）堿性磷酸酶（3）連接酶（體外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酶：大腸桿菌連接酶和T4噬菌體連接酶），但幾乎在所有的克隆中T4噬菌體連接酶都是首選的酶，因其能在正常的反應條件下能有效的將平端連接起來。
2. 載體的負載能力：即能克隆多大的DNA片段，是否有合適的限制性內切酶位點，酶切位點的性質，粘性或平末端，是否有選擇重組克隆的其它標記，如藍白斑篩選等。 |
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