摘要：雙鏈DNA分子轉化為兩個單鏈分子，DNA分子變性或熔解用于研究DNA結構和組成已經有多年。最近，新技術的進步提高了這種技術的潛力，尤其是用于DNA序列突變的檢測。通過飽和DNA染料的發展和設備的改善，熔解的靈敏度和特異性有了很大的提高（改良的溫度精確地結合每個時間單位溫度的精確測量）。熔解分析已使用這些新設備用于高分辨熔解曲線分析（HRM或HRMA）。基于它的易用性、靈活性、低成本、非破壞性、高靈敏度和特異性的特點，高分辨熔解曲線分析已成為篩選病人致病突變的首選工具。這里我們將簡短地討論高分辨熔解曲線分析目前的發展，特別回顧它在其它方面的應用，包括前序列篩查，單核苷酸多態性分型，甲基化分析，定量（拷貝數變異和鑲嵌性），替代凝膠電泳和克隆。總之，這些不同的應用使高分辨率熔解曲線分析成為了一種多用途的技術和標準，可用于任何核酸研究的實驗室中
關鍵詞：突變篩查；甲基化；熔解曲線分析；HRM；HRMA
硬件
有幾個供應商生產高分辨熔解曲線分析系統（HRM或HRMA）。整體而言，這些系統能達到預期的結果，但是差異很大[Herrmann et al.,
2006,
2007]。目前可用的靈敏度最高的系統是HR-1(鹽湖城市，由他大學，愛德華科技有限公司)，熒光信號產生于55—95℃，溫度以0.1℃/s升降，200個數據點/℃。一些實驗，例如，多個SNP測定[Seipp
et al.,
2008]，關鍵取決于這個分辨率。HR-1使用玻璃毛細管每次分析一個樣品；其它玻璃毛細管系統可分析32個樣品。微孔板系統更受歡迎、使用方便，可同時分析96或384個樣品。另一個區別是系統是否僅用于高分辨率熔解曲線分析或是否是PCR結合高分辨溶解曲線分析的設備。Rouleau等很好地證明了定量PCR結合HRMA設備在同一個實驗中可以用于定量（缺失/重復）和定性（核苷酸）的改變。
在大多數系統中小的板孔之間的溫度差異影響靈敏度。Seippet al.
[2007]通過增加控制溫度的低溫和高溫溫度校準探針避免這個問題。分析軟件可以利用探針的熔解位置彌補板孔之間的溫度差異，減小Tm標準偏差38%，顯著地提高了靈敏度。值得注意的是，高分辨熔解曲線分析軟件的使用決定最終靈敏度的重要因素[Herrmann
et al.,2007]，但并不是所有的軟件包有利于溫度校準探針的使用。
LC-Green是第一種可用的飽和染料[Wittwer
et al.,2003];目前，已有多種飽含染料。包LCGreens1(IdahoTechnology Inc.), Syto9s
(Invitrogen, Carlsbad, CA), EvaGreens (Biotum) 和LightCyclers 480
ResoLight Dye (Roche,
Indianapolis,IN)。價格差異很大；所有的飽和染料都有一些差異，它們對PCR緩沖液和反應條件要求略有不同。
高分辨熔解曲線分析的完成非常簡單。最簡單的設置，不需要對現有條件修改，添加染料后進行PCR熔解。這個簡單方法允許我們，例如很快的區分apoE等位基因的所有可能情況（Fig.1A）。ApoE使用其它分型技術存在許多問題，主要是要求每個等位基因區分開。最后，高分辨熔解曲線分析是一個閉管實驗，染料在PCR反應前加入更好。如果實驗要求改變PCR條件，通常可以增加鎂離子濃度2-3
μL，退火溫度增加1-5℃。當鎂離子濃度升到設備的最大溫度以上時，加像二甲基亞砜（10%）或犢牛血清（0.5M）可以降低Tm值。對于復雜的實驗，使用梯度PCR儀可以快速的確定最佳的退火溫度。
高分辨率熔解曲線分析在不同實驗室不要求有大的改變，同時也不要特別的技術；它是在有特殊染料存在的條件下PCR條件過程進行小的修改。最昂貴的是設備的購買。在10,000-50,000歐元之間，根據系統，甚至其它一些技術相比它并不遜色。因為高分辨率熔解曲線分析不像許多其它技術（例如，SSCA，DHPLC，DGGE,或毛細管電泳），不需要PCR后分離，更重要的是節省成本。此外，高分辨熔解曲線分析是一個非破壞性的技術，同時可以進行后續的分析，比如，熔解分析后進行凝膠電泳或測序。
圖1.使用高分辨熔解曲線分析檢測序列突變。A：檢測所有六個可能的ApoE等位基因組合；PCR后高分辨熔解曲線分析前添加LC-Green+染料（PCR包含10%DMSO）。ApoE 3/3等位基因作為標準（水平的灰線）。B-D：使用氨基封閉的非標記探針檢測MBL2基因第一個外顯子的3個獨立突變(Roos et al., in preparation)。B：衍生圖全圖；C:放大的低熔解探針和D：（PCR片段）Tm峰。使用熔解圖10種等位基因可以清楚地區分。