⒊ 注射抗原
⑴
準備兩只成年兔，將100μg抗原/兔溶入1ml磷酸緩沖溶液中待用。在1ml福氏不完全佐劑中加入分枝桿菌制成完全佐劑，并加入1ml抗原溶液，劇烈震蕩使之充分乳化，用3ml注射器抽取該乳化液，接上25G針頭，排除注射器中的氣泡。從籠中取出兔子放在平坦處，在4個不同的部位進行皮下注射，兩處在后背，兩處在大腿處。撫去注射處的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮膚。捏出皮膚，將針頭以相對皮膚15度的角度進針，進針深度為1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4個不同部位分別各注射約500μl抗原溶液。注射結束后，將針在注射處放置幾秒鐘后再輕輕拔出，并用乙醇在注射處消毒。在4個部位重復上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。
⑵ 每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步驟2收集血液。將收集的血液與注射前收集的血液進行比較，檢查是否有抗體產生。待確定產生抗體后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。
⒋ 收集血液
⑴
將家兔輕輕放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片傾斜45°在該處切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在結束之前出現凝固可用溫水輕擦切口處，再繼續收集。收集適量血液后可用消毒后的紗布輕擦患處，輕按患處10秒-20秒確定血流停止后方可結束。
⑵ 將血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘，再在4°C放置過夜。用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉移至塑料離心管中，4°C，10,000g離心10分鐘，收集上清液即為抗血清，可在-20°C保存數年。
【實驗結果】
利用蛋白質免疫印跡法或免疫電泳方法檢查抗體產生情況。
二、親和層析法純化抗體
【實驗原理】
如圖所示，親和層析的高度選擇性使得從某一初始材料中純化，富集某一含量較低的目的蛋白成為可能，因此親和層析是蛋白質分離純化過程中最有效的方法之一。另外，如果配基與蛋白質的親和能力很強，也可同時進行樣品的濃縮。
雖然多數情況下不需要將抗體與其他血清蛋白分開，但如果一旦需要，蛋白A親和層析是一種非常有效的分離方法。蛋白A是從Staphylococcus
aureus中獲得，可與抗體重鏈的Fc片段相結合。現在已知蛋白A可與多種哺乳動物的IgG相結合也可與某些IgM和IgA相結合。如果將蛋白A與固相載體相連，例如sepharose
CL-4B，這種填料可以成為分離和純化不同類型，不同亞類抗體或抗體片斷的重要工具。
【實驗材料】
⒈. 實驗儀器
蛋白A柱（含10ml或5ml填料）；泵；離心管；離心機；pH試紙；過濾器；玻璃柱。
⒉.實驗試劑
⑴ TBS緩沖溶液：6.06g Tris (50 mM), 8.78g NaCl (150 mM)以及0.5g疊氮化鈉(0.05%)溶于1L蒸餾水中，并用HCl調節pH 7.4。
⑵ 中和緩沖溶液：121.2g Tris (1 M), 87.8g NaCl (1.5 M), 0.37g EDTA (1mM)及5g疊氮化鈉(0.5%)溶于1L蒸餾水中，并用HCl調節pH8.0。
⑶ 洗脫緩沖溶液(pH2.7)：將3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸餾水中，用HCl調節pH 2.7。
⑷ 洗脫緩沖溶液(pH1.9)：將3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸餾水中，用HCl調節pH 1.9。
【實驗方法】
⒈ 準備蛋白A sepharose CL-4B親和柱
通常準備5ml或10 ml蛋白A sepharose
CL-4B填料，在真空瓶中將等體積的填料和TBS緩沖溶液混合，攪拌。抽真空約15分鐘以除去填料中的氣泡，否側在柱中形成的氣泡影響柱子的容量和分離效果。將蛋白A
sepharose CL-4B填料緩慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度為1 ml/分-2
ml/分，避免柱干，利用10倍于床體積并經過預冷的TBS緩沖溶液平衡柱子。
⒉ 制備抗血清
將抗血清放入冰水或4°C冰箱中緩慢解凍以避免蛋白質的聚集。在蛋白質解凍過程中出現的聚集可通過37°C預熱而溶解。加入固體疊氮化鈉至濃度為0.05%，4°C，15,000xg離心5分鐘，移出澄清的抗血清再經過濾器過濾除去多余的脂。
⒊ 親和層析
將抗體用TBS緩沖溶液以1：5的比例進行稀釋，再用過濾器進行過濾。以每分鐘0.5
ml的速度將抗血清上到柱上,為保證抗血清與填料的結合，需連續上柱2次并保留上樣流出液。用TBS緩沖溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008
后加pH2.7洗脫緩沖溶液，以0.5ml/min的速度洗脫至所有蛋白均流下來。用已經加入100ul中和緩沖溶液的1.5 ml
EP管分管收集洗脫液，混勻后用pH試紙檢查洗脫液的pH，如果pH低于7可利用中和緩沖液調至約pH7.4以防止抗體的變性。
在柱中加入 10ml,pH1.9洗脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液至Aλ280nm<0.008。
利用分光光度計測定各管中蛋白質的含量。若蛋白濃度低于0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，將純化的抗體分裝后在2°C~8°C保存。
用含0.05%疊氮化鈉的TBS緩沖溶液清洗柱子后將柱子儲存在2°C~8°C環境。
【實驗結果】
利用SDS/PAGE檢查洗脫獲得的蛋白純度并利用免疫電泳技術檢查純化后抗體的滴度。
【注意事項】
⒈ 疊氮化鈉有毒，應戴手套并小心操作
⒉ 在純化過程中，預冷的TBS緩沖溶液可減少蛋白質的非特異性結合和微生物的代謝。
三、免疫電泳
【實驗原理】
免疫電泳又稱為γ球蛋白電泳或免疫球蛋白電泳技術，這是一種能夠判斷血液中三種免疫球蛋白IgM, IgG,
IgA含量水平的實驗方法。在這項實驗技術中，首先利用蛋白質的分子量和所帶電荷的比值運用水平瓊脂糖凝膠電泳技術將蛋白質進行分離，然后將特異性的抗體引入到與電泳方向平行的凹槽中，在抗原和抗體的擴散過程中，抗原和抗體適當比例的結合會導致沉淀的產生（如圖）。0.85%鹽不僅可以終止擴散過程也可用于洗去未結合的蛋白，抗原和抗體結合所形成的沉淀線即可以肉眼觀察也可利用染色方法觀察。
免疫電泳技術不僅可用于血清或尿樣中單克隆抗體的鑒定，也可用于其它方面，比如免疫復合物的篩選、各種異常丙種球蛋白血癥的識別和鑒定等。免疫電泳技術也是進行蛋白質常規評價的一種可靠，精確的實驗方法，可觀察蛋白質結構的變化和濃度的改變。
【實驗材料】
⒈ 實驗器材
水平電泳儀；打孔器；滴管；刀片；電源；水浴(55°C)；蒸餾水；燒杯 (400-600ml)；
加樣槍(5-100ul)。
⒉ 實驗試劑
⑴ 純化的抗體；蛋白質混合物；1%瓊脂。
⑵ Tris-巴比妥緩沖溶液：2.24g 巴比妥酸，4.43g Tris，0.053g 乳酸鈣及0.065g 疊氮化鈉溶于100ml 蒸餾水中。
⑶ 電泳緩沖溶液：將Tris-巴比妥緩沖溶液與蒸餾水按1：4的比例混合。
【實驗方法】
⒈ 準備瓊脂糖凝膠
將瓊脂和電泳緩沖溶液混合放入90°C水浴加熱至溶化，制成1%瓊脂，將瓊脂在冷卻前鋪在水平玻璃板上，待冷卻至室溫后，按圖用內徑4毫米的打孔器打孔及制作凹槽。
⒉ 電泳
將用電泳緩沖溶液稀釋的4%-5%的抗原用滴管小心放入小孔中，將膠板放入電泳槽中并用潤濕的濾紙將膠板和電泳槽中的緩沖溶液相連。蓋上電泳槽蓋，接通電源，6V/cm通電至前沿移動約35mm，時間約為1小時，利用示蹤染料判斷移動距離。
⒊ 擴散
將膠板移出電泳槽并放在水平位置上,用濾紙潤干膠板凹槽中的緩沖溶液,在凹槽中加入適量的抗體(0.2ml~0.25ml)，注意抗體不能溢出凹槽以避免污染.將膠板移至含有疊氮化鈉且有一定濕度的盒內,加蓋密封后在30°C水浴擴散至少10小時后，移至0.85%鹽水中以終止擴散并洗去未結合的蛋白。
【實驗結果】
觀察抗原和抗體之間所形成的沉淀線，并進行記錄