朗伯-比爾定律
當一束平行單色光通過任何均勻、非散射的固體、液體或氣體介質時，一部分被介質吸收，一部分透射出介質，一部分被器皿的表面反射。
在吸光光度的分析中，通常將待測物溶液和空白溶液分別置于同樣質料及厚度的吸收池中，此時反射光強度基本上是不變的，其影響可以忽略。
雙波長測試法
根據朗伯-比爾定律，物質的濃度不同，對光譜的吸收也會不同。將不同波長的光連續地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到不同波長相對應的吸收強度。如以波長（λ）為橫坐標，吸收強度（A）為縱坐標，就可繪出該物質的吸收光譜曲線。利用該曲線進行物質定性、定量分析的方法，稱為分光光度法。為了扣除環境和雜質吸收的干擾，采用同一時間測量兩個特征光譜，然后相減的方法，即雙波長測試法來扣除環境的干擾。儀器用主波長測量出吸光度 A1，同時用副波長測量出吸光度 A2，差值 AC=A1-A2作為待測物溶液的吸光度，用來計算待測物含量。雙波長測試法能有效去除樣本混濁的干擾，有效抵消光源的波動和電路的噪聲。在波長的選擇時，應選擇干擾因數對主副波長的吸光度影響盡可能接近的兩個波長。