多糖多酚植物RNA快速提取的方法

操作步驟：

提示：

（1） 第一次使用前請先在漂洗液RW瓶加入指定量無水乙醇!

（2） 操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT 中加入10μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的RLT 4℃可放置一個月。

1. 直接研磨法（推薦）:

a.  新鮮植物組織稱重后取100mg迅速剪成小塊放入研缽（冰凍保存或者液氮保存樣品可直接稱重后取100mg放入研缽）， 加入10體積（1ml）RLT(請確定已加入β-巰基乙醇)和1體積（100μl） PLANTaid 室溫下充分研磨成勻漿，注意應該迅速研磨讓組織和裂解液RLT立刻充分接觸以抑制RNA酶活性。

b.  將裂解物轉入離心管，劇烈搖晃振蕩15秒，13，000rpm離心5-10分鐘,沉淀不能裂解的碎片和結合有多糖多酚的PLANTaid，取450μl裂解物上清轉到一個新離心管。

c.  加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時可能出現沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。

d.  立刻接操作步驟項下3。

2. 液氮研磨法:

a.  取500μl裂解液RLT(已經加入β-巰基乙醇)，轉入1.5ml離心管中，加入50μl PLANTaid混勻備用。

b.  液氮中研磨適量植物組織成細粉后，取50mg細粉轉入上述裝有RLT和PLANTaid的離心管, 立即用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。

在56℃溫育1-3分鐘有助于裂解植物,但是淀粉含量高的植物不能溫育,因為提高的溫度可能導致淀粉膨脹。

c.  用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產量。

d.  將裂解物13，000rpm離心5-10分鐘,沉淀不能裂解的碎片和結合有多糖多酚的PLANTaid, 將所有裂解物上清轉到一個新離心管。

e.  較精確估計裂解物(上清)體積,加入0.5體積的無水乙醇,此時可能出現沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。

f.  立刻接操作步驟項下3。

3. 將混合物(每次小于700μl,多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心60秒，棄掉廢液。

4. 加700μl 去蛋白液RW1，室溫放置30秒，12，000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

如果DNA殘留明顯,可在加入RW1后室溫放置5分鐘后再離心。

5. 加入500μl漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RW,重復一遍。

6. 將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

7. 取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加熱效果更好）， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。

8. 如果預期RNA產量>30μg,加30-50μl RNase free water重復步驟7, 合并兩次洗脫液,或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。

洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產量比前者高15–30%,但是濃度要低,用戶根據需要選擇。