1、準備1mTU/HOBt溶液
1)配制0.5mol/LHOBt的DMF溶液：稱量13.5g無水HOBt（相對分子質量135.1），置于250ml燒杯中，加入DMF至200ml。
2)配制0.45mol/LHBTU/HOBt溶液：將上述溶液倒人裝有37.9gHBTU（0.1mM）的燒杯或燒瓶中。
3)利用磁力攪拌裝置攪拌15min，直到HBTU完全溶解。
4)利用漏斗和濾紙對溶液進行過濾。
5)選擇合適的容器收集濾液，備用（該溶液室溫下穩定期至少為6周）。
2、氨基基團與生物素結合
1)用DMF洗滌0.1mmol樹脂。
2)將0.244g生物素溶解于5ml的DMF-DMSO（體積比1：1）溶液中，可以適當加熱以加速溶解。
3)在上述溶液中加入2.1ml0.45mol/LHBTU/HOBt溶液和0.3mlDIEA。
4)將活化生物素溶液加入柱子中，旋轉過夜。
5)進行二氫茚三酮測試（無色），確認生物素已經與柱子結合。
6)用2XDMF-DMSO（1：1）溶液洗滌柱子，去除多余的生物素
7)依次用2XDMF和2XDCM洗滌柱子。
8)肽段脫離之前，柱子要進行干燥。
3、將Fmoc氨基酸裝入2-ChlorotritylChloride柱中
1)用反應管道稱量log 2-ChlorotritylChloride樹脂（15mmol），用2XDMF洗滌后，在50ml的DMF中浸泡10min，排盡管道中的液體。
2)用試管稱量10mmolFmoc氨基酸，用40mlDMF進行溶解，將溶液轉移至上述反應管道中，加入8.7mlDIEA（50mmol），室溫下渦旋30min。
3)再向反應管道中加入5ml甲醇，渦旋5min。
4)排盡管道后用5XDMF洗滌。
5)檢查替代率。
6)加入50ml20%六氫吡啶，去除Fmoc基團，渦旋30min。
7)依次用5XDMF和2XDCM洗滌后，將樹脂放置于泡沫板上的薄紙上，于室溫下干燥過夜。將另一張薄紙覆蓋在樹脂上，輕輕擠壓，以破碎聚集物。
8)對樹脂進行稱重，并裝入合適的容器內備用。
4．檢查含有Fmoc氨基酸樹脂的替代率
1)用微量離心管稱量雙份5～10mg含Fmoc氨基酸樹脂樣品，加1.00ml20%六氫吡啶/DMF，振蕩20min后，離心使樹脂沉降。
2)將100ul上清液轉移至裝有10mlDMF的試管中，混合均勻。
3)用移液管分別轉移2mlDMF到參比杯和樣品杯中，將分光光度計調零，利用參比杯調空白后，向樣品杯中加入2ml步驟2)中所得溶液，讀取光吸收值。
4)利用下列公式進行替代率（Subs）的計算： Subs＝101（A）/7.8（w），式中：A＝光吸收值；w＝樹脂的質量（mg）。
5)在301nm處測試光吸收值3次，計算平均替代率。
5、Fmoc合成的步驟
1)用4XDMF洗滌樹脂后排盡液體。
2)向樹脂中加入約10ml20%六氫吡啶/DMF，振蕩1min后排盡。
3)再加入10ml20%六氫吡啶/DMF，振蕩30min。
4)排盡液體后再用4XDMF洗滌樹脂，確保沒有六氫吡啶殘留。用二氫茚三酮測試進行檢驗，樹脂顆粒應該顯藍色。將1mmolFmoc氨基酸、2.1ml0.45molHB-TU/HOBT（1mmol）、348glDIEA（2mmol）加入樹脂中，振蕩不少于30min。
5)排盡液體后用4XDMF洗滌樹脂。
6)進行二氫茚三酮測試，若為無色，從步驟2)開始重新合成；若為藍色，回到步驟5)與Fmoc氨基酸重新結合，如有需要，可增加這一步的反應時間。
6、用Fmoc-磷酰酪氨酸合成含磷酰酪氨酸的肽段
所需試劑：Na-Fmoc-O-磷酰酪氨酸1g。
1)若用ABI多肽合成儀進行0.1mmol或0.25mmol的合成，使用0.483gFmoc-Tyr（PO3H2）-OH（1mmol）即可，將Fmoc-Tyr（PO3H2）-OH裝好備用。
2)結合Fmoc-Tyr（PO3H2）-OH的步驟與其他Fmoc氨基酸結合步驟，除了結合時間（見下一步）以外，基本相同（注意：ABI多肽合成儀利用HBTU/HOBT作為催化劑）。
3)需要增加Fmoc-Tyr（PO3H2）-OH的結合時間。例如，ABI公司的合成儀430A加入了較多步驟，如有必要可以進行過夜反應。
4)完成Fmoc-Tyr（PO3H2）-OH結合后，進行二氫茚三酮測試，若無色，說明結合完全，若顯藍色，說明尚未完全結合。
5)在磷酰酪氨酸結合后或進行同步結合時，要增加氨基酸殘基的反應時間（注意：在磷酰酪氨酸結合后進行氨基酸殘基結合比較困難）。
6)由于磷酸基團未被保護，很有可能發生側鏈反應，因此在磷酰酪氨酸上結合的氨基酸數目是有限制的（注意：磷酰酪氨酸上結合10個氨基酸的多肽已經成功合成）。
7、被保護肽段的脫離
原始樹脂：Chlorotrityl樹脂；lg含肽段樹脂所需試劑：1ml乙酸（AcOH）：2ml。
1)準備上述試劑的混合溶液。
2)將含肽段樹脂加入上述溶液中，室溫下攪拌1h。
3)過濾，并用2X10mlTFE：DCM（2：8)）混合溶液洗滌樹脂，確保所有產物復性。
4)蒸發溶液使得液體體積少于5ml。
5)向含有10ul上述溶液的試管中加入醚，觀察被保護肽段在醚中的溶解性。若有沉淀，進行步驟6)若沒有沉淀，進行步驟7)。
6)向步驟4)的溶液中加人冷卻的醚，使得被保護的肽段完全沉淀。進行過濾可獲得多肽產品。
7)一些被保護的肽段在醚中溶解，這種情況下需要加水使其沉淀，進行過濾即可獲得產品。
8、固相結合的Fmoe-lys（Mtt）的Mtt基團脫除
所需試劑：Fmoc-Lys（Mtt）-OH1g。
1)在DCM中浸泡樹脂使其膨脹。
2)用2X3%TFA/DCM洗滌樹脂（由于樹脂已經在DCM中膨脹，這一步用3%TFA/DCM快速洗滌確保了TFA的濃度精確為3%）。
3)在3%TFA中振蕩樹脂10min。
4)重復步驟3)。
5)依次用3XDCM、3XDMF、3X異丙醇、3XDCM洗滌樹脂。
6)將樹脂在空氣中干燥。
9、肽段的FITC標記
所需試劑：FITC1g，Fmoc-Ahx-OH1g。
1)在標準結合條件下將Fmoc-Ahx-OH與肽段的氨基酸N端結合。
2)用20%六氫吡啶脫去Fmoc基團。
3)用3XDMF或4XDMF洗滌樹脂。
4)將樹脂浸泡在DCM中使其膨脹，而后排盡液體。
5)配制FITC的吡啶/DMF/DCM（12：5：7）溶液。向樹脂中加入足夠的溶液制成懸浮液。注意溶液的用量，因為反應的速率與懸浮液的濃度成正比。
6)加人步驟2)中所得溶液。
7)過夜混合。
8)利用二氫茚三酮反應檢測反應是否進行完全。若FITC與氨基未完全結合，反應顯藍色，需要重新進行步驟5)～7)。
9)依次用2XDMF、2X異丙醇、2XDCM洗滌樹脂。