多肽固相合成簡介

R.Bruce Merrifield在肽合成的技術方面發明了一種突破性技術，并將其命名為多肽固相合成（solid-phase peptide synthesis, SPPS）, 1984年Merrifield因此獲得了諾貝爾獎。
固相合成順序一般從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。
首先，將C段的氨基酸與特定的樹脂通過化學鍵鏈接，氨基酸α-氨基用Fmoc保護，側鏈基團用相應的對酸敏感的保護基團保護；
第二步，用堿性溶液比如六氫吡啶DMF溶液將α-氨基的保護基團Fmoc脫除，此時，留在樹脂上的是α-氨基裸露出來的第一個氨基酸；
第三步，加入過量的α-氨基用Fmoc保護，側鏈基團用相應的對酸敏感的保護基團保護的第二個氨基酸，縮合劑等，讓其與連接在樹脂上的第一個氨基酸進行縮合反應；
第四步，檢測，檢測一般是通過檢測上一個氨基酸裸露的α-氨基，一般用茚三酮檢測，如果檢測有裸露的α-氨基，說明未反應完全，重復第三步驟，如果反應完全，則重復第二、三、四步直至所有的氨基酸都縮合完，然后將最后一個氨基酸α-氨基上的Fmoc脫除（方法同第二步）；
最后，用酸（常用三氟乙酸）將肽鏈從樹脂上切割下來，同時，應為氨基酸側鏈保護基團選用的是對酸敏感的基團，因此，這一步，也將側鏈上的保護基團一起去除，從而得到我們需要的多肽粗品。

（1）樹脂的選擇及氨基酸的固定
固相合成的特征是合成過程中使用了固相載體，能用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求：
一，必須包含反應位點（或反應基團），以使肽鏈連在這些位點上，并在以后除去；
二，必須對合成過程中的物理和化學條件穩定；
三，載體必須允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；
四，載體必須允許提供足夠的連接點，以使每單位體積的載體給出有用產量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。

用于固相法合成多肽的高分子載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物，這些樹脂還需要導入反應基團，才能直接連上（第一個）氨基酸。根據所導入反應基團的不同，又把這些樹脂及樹脂衍生物分為氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或酰肼型樹脂。BOC合成法通常選擇氯甲基樹脂，如Merrifield樹脂；FMOC合成法通常選擇羧基樹脂如王樹脂（wang resin）。

氨基酸的固定主要是通過保護氨基酸的羧基同樹脂的反應基團之間形成的共價鍵來實現的，形成共價鍵的方法有多種：氯甲基樹脂，通常先制得保護氨基酸的四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽，然后在適當溫度下，直接同樹脂反應或在合適的有機溶劑如二氧六環、DMF或DMSO中反應；羧基樹脂，則通常加入適當的縮合劑如DCC或羧基二咪唑，使被保護氨基酸與樹脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基樹脂或酰肼型樹脂，卻是加入適當的縮合劑如DCC后，通過保護氨基酸與樹脂之間形成的酰胺鍵來完成氨基酸的固定。

（2）氨基、羧基、側鏈的保護及脫除
要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護，同時對氨基酸側鏈上的活性基因也要保護，反應完成后再將保護基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧羰基類型作為α氨基的保護基，因為這樣不易發生消旋。最早是用芐氧羰基，由于它需要較強的酸解條件才能脫除，所以后來改為叔丁氧羰基（BOC）保護，用TFA（三氟乙酸）脫保護，但不適用含有色氨酸等對酸不穩定的肽類的合成。chang Meienlofer和Atherton等人采用Carpino報道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護基，Fmoc基對酸很穩定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來，Fmoc合成法得到了廣泛的應用。羧基通常用形成酯基的方法進行保護。甲酯和乙酯是逐步合成中保護羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉變為肼以便用于片斷組合；叔丁酯在酸性條件下除去；芐酯常用催化氫化除去。對于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側鏈功能基的氨基酸的肽來說，為了避免由于側鏈功能團所帶來的副反應，一般也需要用適當的保護基將側鏈基團暫時保護起來。保護基的選擇既要保證側鏈基團不參與形成酰胺的反應，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時又要保證在最后肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環用2,2,2-三氟-1-芐氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護，用冷的三氟乙酸脫去。

（3）氨基酸的縮合
固相中的接肽反應原理與液相中的基本一致，將兩個相應的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽應用最廣。

（4）多肽純化
合成肽鏈的分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細管電泳等。目前最常用的為HPLC純化。分析HPLC使用柱子和泵系統，可以經受傳遞高壓，這樣可以用極細的微粒（3-10μ m）做填料。由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。

HPLC分兩類：離子交換和反相。 離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現出相反電荷。分離是一種電荷相互作用，通過可變PH， 離子強度， 或兩者洗脫出多肽，通常， 先用低離子強度的溶液，以后逐漸加強或一步一步加強，直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。

反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強度洗脫， 如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。 由于洗脫是一種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而，總體實踐中， 這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構成， 比如苯基。典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m)。如果用徑向填柱，那么大小是8×100（3-10μ m）和25×250mm(10μ m)。 nbsp;      大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸， 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3，醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點：硅反相柱料不能長時間暴露于高pH，甚至微堿pH， 因為這樣會破壞柱子。

總結：近10年來，多肽固相合成在國內快速發展，肽谷生物在多肽合成領域不斷摸索創新，形成了一套獨特穩定的合成管理體系，在保證質量的前提下，提高上產效率，降低了成本，為國內外一大批科研工作者提供了方便、快捷、穩定的多肽合成選擇方案。