dNTP和MgCl 2 的濃度（步驟 5D）.
dNTP. 用引物混合物 Y-4 檢測了多重 PCR 反應中 dNTP 濃度的影響。氯化鎂濃度保持恒定 (3 mM) ，而 dNTP 的濃度從每種 50 μ M 逐漸增加到每種 1200 μ M(Figure 4b) 。當 dNTP 濃度為每種 200 μ M 和每種 400 μ M 時結果最好，濃度繼續增加時擴增被迅速抑制。降低 dNTP 濃度 (50 μ M) 不抑制擴增，但擴增產物的量會減少。 dNTP 母液對于反復凍融十分敏感，反復凍融 3–5 次后，多重 PCR 反應常常不能很好進行，擴增產物幾乎完全不可見。為了避免這一問題，應分裝出小份的 dNTP(25 mM each, 2–4 μ L, 10–20 次反應 ) ，凍存于 -20 ℃，使用前離心。 dNTP 的這種低穩定性在單一基因擴增中并不明顯。
MgCl 2 . 在 dNTP 濃度為每種約 200 μ M 的標準 PCR 反應中 MgCl 2 的濃度建議為 1.5 mM 。為測試 MgCl 2 的影響，將 dNTP 濃度保持在 200 μ M 進行多重 PCR 反應 (mixture Y-3) ， MgCl 2 濃度從 1.8mM 逐漸增加到 10.8 mM (Figure 4c) 。隨著 MgCl 2 濃度的逐漸升高，擴增反應的特異性逐漸增強（非特異性條帶消失），產物量逐漸增多 (10.8 mM) 。在 MgCl 2 濃度為 20 mM 的 PCR 反應中，產物幾乎不可見，似乎反應被抑制了。
dNTP/MgCl 2 的平衡 . Taq DNA 聚合酶正確工作時需要游離的鎂離子 (9) （不包括與 dNTP 和 DNA 結合的鎂離子）。這也許是 dNTP 濃度增加時擴增反應被迅速抑制 (Figure 4b) 而增加鎂離子濃度能消除這種抑制現象 (Figure 4c) 的原因。通過對各種 濃度 dNTP 和 MgCl 2 的組合實驗發現，濃度為每種 200 μ M 的 dNTP 要得到最好的擴增結果需要 1.5–2 mM MgCl 2 ，而濃度為每種 800 μ M 的 dNTP 要得到最好的擴增結果至少需要 6–7mM 的 MgCl 2 。濃度為每種 200 μ M 的 dNTP 擴增反應要求的 閾 值為 1 mM MgCl 2 ，當 MgCl 2 低于這一閾值時，擴增會減少。
PCR 緩沖液（ Kcl ）的濃度 . PCR 緩沖液的比較 (Step 5, B–D).
KCl 或 PCR 緩沖液濃度 . 提高 PCR 緩沖液的濃度為 2x （或僅將 KCl 的濃度增加到 100mM ）可以提高多重 PCR 的效率 (Figure 4d 及 Figure 3, d–f) ，這種調節作用比調節 DMSO ，甘油或 BSA 更重要。通常產生長片斷擴增產物的引物在低鹽濃度下擴增結果更好，而產生短片斷擴增產物的引物在高鹽濃度下擴增結果更好，高鹽濃度會使長片斷擴增產物難于變性解鏈 ( 比較 Figure 4d 中 0.4x 緩沖液與 2.8x 緩沖液 ) 。例如， sY94 引物對 ( 熔點為 58 ℃ ) 在緩沖液的濃度為 0.8x 時擴增效果優于 sY88 引物對 ( 熔點為 58 ℃ ) 和 sY151 引物對 ( 熔點為 52 ℃ ) ，但在高的鹽濃度條件下， sY94 引物對的擴增效果無明顯優勢。合適的緩沖液濃度可以克服產物大小和 GC 含量等因素的影響。
PCR 緩沖液的比較 . 我們還比較了原先提到的被稱為 DMD 的多重 PCR 緩沖液 (6) 和相對簡單的 KCl 緩沖液在多重 PCR 反應中的差異。 5x 的 DMD 緩沖液含有 83 mM(NH 4 ) 2 SO 4 , 335 mM Tris-HCl (pH8.8), 33.5 mM MgCl 2 , 50 mM β -mercaptoethanol （β－巰基乙醇）和 850 μ g/mL BSA ，緩沖液 DMD 的使用終濃度為 1x ，與 10% DMSO 和 1.5 mM each dNTP 同時使用 (1,2,4) 。實驗表明用 1.6x 的常規 KCl 緩沖液比用 DMD 緩沖液擴增 DMD 基因 ( 引物混合物 X-1) 效果更好，明顯見到更多的 PCR 產物 (Figure 4e) 。實驗結果使用病人的 DNA 樣品做了十二次重復，重復性很好。 KCl 緩沖液相對簡單，便于調節和優化實驗。低 dNTP 濃度時 Taq DNA 聚合酶的保真性更高 (9) 。使用 KCl 緩沖液（要求更少的 dNTP ）有利于對 PCR 產物做進一步的突變分析。
模板 DNA 的量和 Taq DNA 聚合酶 ( 步驟 5, A 和 D). 當每 25 μ L 反應體積中 DNA 的模板量為 30ng 到 500ng 時，混合物 Y-3* 未表現出明顯差異 (Figure 4f) ，然而當模板量低于 30ng 時，某些 PCR 產物的量會減少。當模板量很低時（ pg 級的 DNA ），擴增的效率與特異性可以通過進一步降低退火溫度來優化，有時甚至要降低 10 ℃ –12 ℃（數據未顯示）。使用引物混合物 Y-3(Figure 5a) 來測試不同 Taq DNA 聚合酶的濃度 (Perkin-Elmer) 。 Taq DNA 聚合酶的最適濃度為每 25 μ L 反應體積中 0.4 μ L 或 2U 。也許是由于 Taq DNA 聚合酶中甘油濃度過高，加入過多的 Taq DNA 聚合酶會導致不同基因擴增不平衡及背景的輕微增高。在 1.6xPCR 緩沖液中使用自制的五種不同來源的 Taq DNA 聚合酶（每 25 μ L 反應體積中加入 2U ）對 Y-4 引物混合物的反應體系擴增得到了相似的結果 (Figure 5b) 。
佐劑的使用： DMSO, 甘油 , BSA (Step 5E). 許多作者建議使用濃度范圍為 5%–10% (v/v) 的 DMSO 和甘油來改善擴增的效率（提高產物量）和特異性（沒有非特異性產物） (9) 。然而在多重反應中， DMSO 的使用會給出矛盾的結果。例如， 5% DMSO 增加了某些基因的產物量，減少了另一些基因的產物量，而對某些基因卻沒有任何影響 (Figure 5c) 。使用 5% 的甘油也得到了相似的結果。因此， DMSO 和甘油的調節對實驗結果的影響要根據具體的實驗來摸索。加入濃度達 0.8 μ g/ μ L BSA （比以前描述得更高）比加入 DMSO 和甘油更能提高 PCR 擴增的效率。 BSA 對任何基因的擴增都未產生抑制作用。
瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠
瓊脂糖 . 長度彼此相差 30–40bp 的多重 PCR 產物在通常使用的 SeaKem 或 NuSieve(FMC BioProducts) 3% 的瓊脂糖凝膠可以很好的區分開。在低電場強度下過夜電泳可以優化每個 PCR 產物條帶的電泳效果，特別是當 PCR 產物小于 400–500 bp 時。
聚丙烯酰胺凝膠 . 為了分離長度僅差幾個 bp 的 PCR 產物（例如微衛星標記）需要使用濃度 6%–10% 的聚丙烯酰胺凝膠 (PAA 膠 ) 。非變性 PAA 膠可以有效的區分非多態性基因，但在這種膠上分離微衛星片斷會出現不正常條帶。例如在分析含有單拷貝人類第 12 號染色體的兩個雜交瘤細胞系的人類第 12 號染色體上某個多態性位點時，對于每一個被檢測的基因位點，在非變性 PAA 膠上都出現了兩個條帶 (e.g., Figure 5d) 。在常規的 6% PAA/7 M urea 測序膠上，每個被檢測的基因位點都僅有一條帶 ( 比較 Figure 5, d 和 e 的產物 ) 。
我們用一系列樣品檢測了多個參數來優化多重 PCR 。對于任何 PCR 反應，為了獲得高特異性的擴增產物，退火溫度和 KCl 濃度（鹽濃度）的最優組合是最重要的。 Mgcl 2 濃度應當與 dNTP 的量成比例，對于任何反應這個比值可以是常數。雖然逐漸提高 MgCL 2 濃度可以增強反應的特異性，但是看起來退火溫度和 KCl 濃度（鹽濃度）對于獲得高產量的特異性 PCR 擴增產物更為重要。在多重 PCR 中調節每一個基因的引物量也很重要。 Figure 1 給出了進行高效的多重 PCR 的有效方法。盡管無法完全列出影響 PCR 反應的所有因素。然而本研究中所提到的參數的優化提供了解決多重 PCR 中常見問題的基本方法。
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