(2)泛影葡胺—右旋糖酐(dextran)液 34％泛影葡胺液10份 60％右旋糖酐液12.5份混合，即為比重1.07～1.09的分層液。分裝于棕色瓶中，4℃冰箱保存備用。2．3％的明膠液稱取明膠3g，溶于0.9％的滅菌生理鹽水，終體積100ml，114.3℃高壓滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存，臨用時37℃預熱10min。
(二)操作方法
1．取抗凝血，自然沉降，如是馬屬動物的血液，可直接直立試管架上，讓其自然沉降1h，取上層血漿。如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3％明膠液，混勻后讓其自然沉降，1h后取上層血漿。
2．2 000r/min離心10min，棄上清。
3．沉淀用Hank’s液混懸后，再2 000r/min離心10min。
4．重復步驟3一次，再用細胞營養液將白細胞制成懸液。此液含有整個白細胞群，包括粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和部分紅細胞。可供白細胞計數用。
5．取2ml細胞分層液于離心管內，同時用毛細吸管吸取約2ml的血漿(自然沉降1h的上層血漿)輕輕加入分層液上，直接加抗凝血也可。
6．以水平轉子離心機2 000r/min離心20min。離心后，可見分成多層，最下層是紅細胞，中間層是分層液，最上層是血漿。在血漿層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個核細胞層。
7．用毛細吸管插入到單個核細胞層并吸取該層，放入另一試管中。
8．以Hank’s液洗滌、離心，最后配制成適當的白細胞濃度。必要時可計數。
(三)注意事項
1．血漿或血液加入分層液中時要小心，緩慢不要打亂液層、不要搖動。也可以將分層液加入到血漿的上層。
2．保持淋巴細胞的活性是非常重要的，所以一般情況下，是現采血，馬上進行分離。
3．經過分層液分離的淋巴細胞層，實際上是單個核細胞層，包括單核細胞，不包括粒細胞。欲分離出純的淋巴細胞，則按下法除去單核細胞，或收獲單核細胞。
T淋巴細胞的分離技術
(一)原理混合單個核細胞懸液在通過尼龍毛柱時，B細胞、漿細胞、單核細胞和一些輔助細胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數T細胞則通過尼龍毛柱，這是獲得富含T細胞群的有效方法。
(二)材料及試劑
1．尼龍毛(Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters)。
2．燒杯、鋁箔、漏斗、一次性手套等。
3．裝填尼龍毛柱，一次性注射器。
4．取自然沉降的上層血漿，過聚蔗糖—泛影葡胺分層液后，獲取的血漿和分層液之間的單個核細胞層。
(三)操作方法
1．尼龍毛的清洗與干燥
(1)戴上已經洗去滑石粉的一次性手套，將尼龍毛(1包或2包，每包35g)放入燒杯中，加入蒸餾水或去離子水，用鋁箔蓋上燒杯并煮沸約10min。
(2)冷卻至常溫，倒入漏斗內，使水滴干。
(3)重復(1)、(2)步驟6次。
(4)將尼龍毛攤在鋪有紗布的方盤內，37℃溫箱干燥2～3天后，貯藏在帶蓋的方盤內。
2．裝尼龍毛柱
(1)取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器頭上套一段帶夾子的膠管。
(2)將尼龍毛梳理，并適當折疊，以適應注射器的直徑，填入注射器內，約20ml的體積。
(3)將填好尼龍毛的注射器連同注射器芯一起包好，高壓滅菌。
3．細胞分離
(1)將注射器固定在支架上，倒入37℃的細胞培養液，關閉閥門一定時間，然后打開閥門，放掉細胞培養液，以清洗幾次尼龍毛，關上閥門。
(2)將要分離的細胞液用預先加溫的培養液稀釋成適當的濃度，約5.00×107個細胞／ml。
(3)將細胞液倒入注射器內，使之沒過尼龍毛柱。蓋上注射器，37℃溫育45min至1h。
(4)打開下口，緩慢放流(1滴／min)，收集于離心管中。
(5)離心，即獲所需的T淋巴細胞。
(6)關閉注射器下口，于注射器內加入0.85％冰冷生理鹽水，振蕩，并套上注射器芯，打開下口，使勁推出注射器內液體，即獲得粘附于尼龍毛上的B淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞等。
(四)注意事項
1．此種分離法，T淋巴細胞也常有一部分被吸附，吸附的多少與尼龍毛的質量有關，與裝柱的松緊也有關系。
2．此法的T淋巴細胞的回收率約20％～30％。
3．用過的尼龍毛可回收，以鹽水洗滌，然后浸入0.1Mol/L的HCl中過夜，然后再同前法清洗。
單核細胞分離技術
(一)鐵粉吸附法
1．材料及試劑
(1)鐵粉或羰基鐵粉(Atomergic chemetals)99％的純度，顆粒小于60μm(Goodfellow Metals)。
(2)強磁鐵(馬蹄形)。
(3)一塊小棒狀磁鐵(約1cm長)。
(4)毛細吸管等。
2．操作方法
(1)稱取一定量的鐵粉，一般為10g，用100ml生理鹽水洗滌4次，去除任何可溶性有毒物質。在倒去鹽水時，用強磁鐵吸住鐵粉。
(2)用50ml生理鹽水混懸鐵粉。搖勻后，分裝于10個瓶中，包扎瓶口，121℃滅菌20min，拿出后立即輕輕搖勻，防止鐵粉結塊，儲藏備用。
(3)臨用前，倒去瓶中的生理鹽水，加入適量的單個核細胞懸液(3ml～5ml，細胞總數為8×107個／瓶)。37℃溫育45min，中間不時晃動，使鐵粉懸浮起來。
(4)加入一塊小磁鐵棒于瓶中，讓其吸住鐵粉以及附著在鐵粉上的細胞。
(5)倒出懸液，此懸液主要是淋巴細胞，離心，收集。
(6)在鐵粉瓶內倒入一定量的Hank’s液，用力振搖后，以強磁鐵吸附，幾分鐘后，倒出液體。
(7)2 000r/min離心液體，管底即為單核細胞。
(二)玻璃板吸附法將分離的單個核細胞傾于無菌潔凈的玻璃平皿內，置37℃30 min～40min，用毛細吸管輕輕吸取懸液，即為淋巴細胞。用適量的Hank’s液沖洗平皿，收獲即為單核細胞懸液。