一、實驗原理
體外連接的重組DNA分子導入合適的宿主細胞中才能大量的進行復制、增殖和表達。研究發現，用含Ca2+
的溶液處理大腸桿菌細胞會易于吸收外源DNA。大腸桿菌吸收外源DNA的過程被稱為轉化。細菌處于容易吸收外源DNA的狀態稱為感受態。用理化方法可以誘導細胞進入感受態，如電轉化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前實驗室常用的制備感受態細胞的方法，其原理是使細菌處于0°C
、CaCl2低滲溶液中，細胞膨脹成球形，細胞膜的通透性發生改變，外源DNA附著于細胞膜表面，經42°C短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物。宿主細胞一般是限制?D修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株，而質粒載體攜帶有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。若將轉化的細胞涂布與于含氨卞青霉素的平板上，則只有那些含有被轉化質粒的細胞才能生存并生長增殖。從而可以篩選出哪個克隆含有質粒。
本實驗以E.coli
JM109菌株為受體細胞，用CaCl2處理受體菌使其處于感受態，然后與pUC18質粒共保溫實現轉化。將經過轉化后的全部受體細胞進行適當稀釋，在含有氨卞青霉素的平板培養基上培養，只有轉化體才能存活，而未有轉化的受體細胞則因無抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。轉化子經過擴增后，可將轉入的質粒DNA分離提取出來，用于電泳分析、限制性內切酶圖譜的制作以及DNA測序等實驗。
二、儀器及試劑
1. 儀器：
恒溫搖床、電熱恒溫培養箱、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺、分光光度計、高速冷凍離心機、臺式離心機。
2. 材料
E.coli JM109受體菌、質粒pUC18。
3. 試劑：
LB培養液（1L）：
胰蛋白胨 10g
酵母粉 5g
NaCl 10g（高鹽）或5g（低鹽）
氨芐青霉素（Ampicillin） 100mg/ml
在三角瓶中將胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高壓滅菌。待冷卻至55℃，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨芐青霉素。然后貯存于4℃備用。
LB平板培養基：
胰蛋白胨 10g
酵母粉 5g
NaCl 10g或5g ，
瓊脂 13g
在三角瓶中依次將上述配方加入1L的重蒸水中并高壓滅菌。待培養基降溫至50℃，取出培養基并輕輕旋轉以使溶解的瓊脂均勻分布于整個培養基溶液中，根據需要加入氨芐青霉素，然后可直接從三角瓶中倒出培養基鋪制平板。90mm直徑的培養皿約需30～50ml培養基。培養基完全凝結后，倒置平皿并貯存于4℃備用。
其它試劑： 0.1M CaCl2溶液、滅菌蒸餾水
三、操作步驟
1. 感受態細菌的制備：
（1）用接種環從E.coli JM109菌平板上挑取一單克隆菌落，接種于裝有5ml LB液體培養基的試管中中，37℃ 220 rpm振蕩培養過夜（12～16h）。
（2）取0.5 ml過夜菌液接種到裝有50ml LB液體培養基三角瓶中中，37℃，220
rpm振蕩培養2－3h，隔20－30min測量OD600值，至OD600值為0.3-0.4。無菌條件下將細菌轉至1.5ml
離心管中，每管1ml菌液，按需要決定管數。
（3） 4℃，12000 rpm，離心2 min，以回收細菌。
（4）倒凈上清液，倒置離心管于濾紙上1min，使殘留的痕量培養液流盡。每管加1ml冰預冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細胞，冰浴30 min 。
（5）4℃，12000 rpm，2 min。
（6）倒凈上清液，倒置離心管1min，使殘留液流盡。每管加100 ul冰預冷的0.1 mol/L CaCl2重新懸浮細胞（重懸時操作要輕），即成感受態細胞懸浮液。
2.細菌轉化：
（1）取3只滅菌的Ep管，分別編號1、2、3、分別加入以下各組分：加入10～20ng質粒DNA（體積小于10ul），同時做兩個對照組：
1號：受體菌對照組： 100ul感受態細胞懸浮液+2ul無菌ddH2O
2號：質粒DNA對照組：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19
3號：正常轉化組：100ul感受態細胞懸浮液+2ul pUC19
（2）輕輕旋轉離心管以混勻內容物，冰浴30min，促進DNA分子在感受態細胞表面的吸附。
（3）轉入42℃水浴2min，通過熱刺激增強CaCL2的作用，使細胞膜產生通道，便于DNA分子的吸附進入，提高轉化率。
（4）迅速轉入冰上冷卻2min，修復細胞膜。
（5）加600u無抗生素lLB液體培養基，搖勻后于37℃，220 rpm，振蕩60min。使受體菌恢復正常生長狀態，并且表達Ampicillin抗性基因。
（6）取200ul菌液涂在含Ampicillin的LB平板，將平板置于無菌臺直至液體被吸收，37℃恒溫培養箱倒置培養12－16h后觀察結果，其余保存于4℃。如果平板上沒有長出菌落，可將之置于37℃恒溫培養箱繼續培養，同時將剩下的500ul菌液離心，倒掉大部分上清，留100ul左右，用移液器吹打重懸，再全部涂于含Ampicillin的LB平板上，置37℃
培養。
（7）觀察并記錄轉化子出現的數目，計算轉化率。
四、注意事項：
1. 實驗中所用的器皿均要滅菌，以防止雜菌和外源DNA的污染。
2. 實驗過程中要注意無菌操作，溶液移取、分裝等均應在無菌超凈工作臺上進行。
3. 必須設對照組，以檢驗實驗過程中是否有污染。
4. 整個實驗過程均需置于冰上。
5. 選用對數生長期細胞，OD600不應高于0.6。