圖1 TAP親和層析純化原理[14]
注：A:標簽中的ProteinA 與固化的IgG 結合緩沖液淋洗去除不能結合的雜蛋白，TEV 酶切分離ProteinA
和靶蛋白；B:利用CBP(Calmodulin binding peptide)-Calmodulin
的相互作用進一步純化復合物，緩沖液洗去雜蛋白。加入過量的螯合劑(EGTA)螯合Ca2+，使純化的復合物與層析柱分離。
TAP 純化時存在蛋白污染問題，很難判斷這些蛋白是真正的相互作用，還是蛋白處理過程中的副產品。為此，有人建議用三標簽的方法[19]，但實驗表明該法也不能排除蛋白的污染。其他標簽也有應用，比較流行的是Flag[20]。GST、His6、生物素等也分別用于蛋白純化，但由于他們有限的親和力及較高的背景，在大規模的蛋白質相互作用研究中未得到廣泛應用。選擇何種標簽也許是個難題，每種標簽都有自身的弱點：大標簽適于規模較大的相互作用研究，但可能影響蛋白的正常折疊和功能；小標簽可能會更大程度的保持蛋白本身的特性，但在表達純化時通常含量較低[21]
2.3 質譜在蛋白質相互作用分析中的應用 在蛋白質相互作用的研究中，質譜最初只是作為鑒定蛋白質的一種快速、高效的方法：混合的蛋白樣品首先經過純化分離、然后通過SDS-PAGE
將復合體中的組分分開，隨后對感興趣的蛋白進行酶解；得到的肽段在質譜中進行鑒定，從而確定樣品中的目標蛋白；但由于分離方法的靈敏度及技術本身的局限，對于那些相互作用較弱、分子量較大或偏堿性的蛋白往往不能達到理想的分析效果，增加了實驗結果的假陰性。定量蛋白質組技術的出現解決了這一問題，而該技術的策略正是較好的利用了質譜的高靈敏度。目前已有許多種研究蛋白相互作用的定量蛋白質組學方法，以下就穩定同位素標記方法為例進行說明。穩定的同位素之間具有“輕”、“重” 之分，而其化學性質又保持相同，這就使得有同位素標記的蛋白在分離純化時具有相同的特性，而在隨后的質譜鑒定中又能根據質量數的差異被區分開。通常采用的同位素標記為2H、13C、15N 以及
18O。加入同位素標記的方法主要分為：代謝標記法(stable isotope-labelled animo acids in
cell culture， SILAC)和化學標記法(isotope-coded affinity tagging，
ICAT)。前者是在培養細胞的過程中加入同位素標記(體內標記) ；后者則是在提取細胞內總蛋白并經過親和純化后加入同位素標記(體外標記)。最后兩種方法都將得到的對照及實驗組樣品混合，進行質譜分析。由于同位素“
輕”、“重”
差異， 質譜能很容易的區分并鑒定實驗組中特異的蛋白質。該方法中，親和純化過程是最大限度的保留實驗組中的差異蛋白而非排除污染蛋白，系統本身的靈敏度在質譜分析中得到保證，這就避免了傳統的定性蛋白質組技術中分離方法本身固有的局限性，大大提高了實驗結果的靈敏度和準確性。Blagoev等[22]采用SILAC 策略研究了在EGF
刺激細胞后，能夠與 Grb2
的SH2結構域結合的相互作用蛋白。兩組細胞分別在含有不同同位素(12C-Arg,13C-Arg)的培養基中生長一段時間，EGF 刺激其中一組細胞(實驗組)10
分鐘，隨后兩組細胞同時裂解、純化并進行LC-MS/ MS 分析。最終228
個蛋白得到鑒定，其中28 個蛋白在被刺激的實驗組中表達水平明顯高于對照組。這些蛋白除了已知的信號分子外，還有一些蛋白參與了信號衰減或具有細胞骨架的功能，此外還鑒定到了未知蛋白質。這表明該方法在研究信號通路中具有較大的潛力，值得一提的是，DNA、RNA、金屬離子或代謝產物等小分子也參與了某些蛋白間的相互作用，進行蛋白活性的調節，或直接與蛋白質結合發揮生物學功能，酵母雙雜交、TAP 等方法對這類相互作用似乎無能為力，而基于質譜的定量蛋白質組學方法則能繼續發揮其自身優勢。
2.4 蛋白質芯片 蛋白芯質片技術的基本原理是將各種蛋白質有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用的芯片，然后，用標記了特定熒光抗菌素的蛋白質或其他成分與芯片作用，漂洗將未能與芯片上的蛋白質互補結合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術，測定芯片上各點的熒光強度，通過熒光強度分析蛋白質與蛋白質之間相互作用的關系，并最終達到測定各種蛋白質功能的目的。Zhu 等[23]置備了高密度的酵母蛋白質芯片，涵蓋了近5
800 種蛋白，用以研究鈣調素結合蛋白。理論上蛋白芯片除了可以研究蛋白間的相互作用外，還可以研究蛋白- 脂類、蛋白- 核酸以及蛋白-
配體間的結合，但目前應用還不夠廣泛，僅用于CaM、磷脂相互作用蛋白、結構域之間以及抗原與抗體的相互作用研究等[23~26]。隨后，Ptacek 等[27]還研究了酵母激酶的相互作用蛋白，發現了近4
000 個磷酸化反應，涉及到1 325 種不同的蛋白 。
2.5 基于生物信息學的分析方法 生物信息學的方法大都基于從已知數據庫中分析比較未知蛋白的功能及其相關的相互作用蛋白，已知的數據庫包括細菌、酵母的全部基因序列或已知的相互作用蛋白。比較基因簇的同源性推測蛋白功能(conserved gene
neighborhood, GN )[28~29]，相關基因具有相似的系統發生模式(co-occurrence of
genes, CO)[30]，相互作用蛋白的基因可能相互融合(gene fusion events,
GF)[31~32] 等，以這些為依據采用適合的軟件就可對大規模的蛋白質－蛋白質相互作用進行分析，目前已有許多網站開發了這樣的功能(表1)。生物信息學分析無需具體的實驗操作，往往是在整個基因組規模上進行研究，可獲得較大的信息量。另外根據蛋白晶體結構的互補性，也可以推測蛋白間可能的相互作用，但遺憾的是這些方法以基因的同源性為前提，若數據庫中沒有同源基因則無法比較。目前大規模研究產生的數據都沒有達到飽和，整合所有的研究數據而不是分析單一的實驗結果，才能得到更加清晰有用的生物學信息。值得一提的是，在細胞中有些蛋白質的相互作用是瞬時的、不穩定的，以實驗為基礎的研究方法很難捕捉到這種相互作用，而基于生物信息學的分析則能彌補這一不足。