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  • 發布時間:2020-09-01 10:53 原文鏈接: 大鼠胚胎神經嵴干細胞的直接分離和培養

    1、培養用液:

    HBSS。含有10mmol/L Hepes 的無鈣、鎂離子的PBS(ph7.4)。

    酶消化液。用HBSS配制,含0.025%胰蛋白酶和1mg/ml III型的膠原酶。

    細胞分散液。含有1mg/ml BSA、10mmol/L hepes、50U/ml青霉素和50/ml鏈霉素、25ug/mlDNA酶1的L15培養基。

    生長培養基。為低糖DMEM培養基,含有15%雞胚浸出液、20ng/ml重組人bFGF、1%N2添加劑、2%B27添加劑、50umol/L2-巰基乙醇、35mg/ml維甲酸、50U/ml青霉素和50ug/ml鏈霉素。

    多聚D-賴氨酸溶液。先用培養用水配置成10mg/ml的儲存液,-20℃保存。

    使用時用硼酸鹽緩沖液稀釋成10ug/ml的濃度。

    易生物試劑庫:

    2、細胞的分離和培養步驟:

    孕期14-17天SD大鼠,用戊巴比妥(65mg/kg)腹膜下注射麻醉,腹部用75%乙醇消毒后,打開腹腔,取出子宮,小心的剪開子宮取出胎鼠。

    將胎鼠脫頸處死后,在解剖顯微鏡下獲取坐骨神經,置于預冷的HBSS中。

    用1ml酶消化液在37℃條件下酶解4min,然后加入2倍體積的細胞分散液終止酶解反應。

    經1000r/min離心5min后,棄去上清,沉淀細胞中加入細胞分散液,用吸管吹打分散,制成單細胞懸液。

    為了獲得神經嵴干細胞,將分離的坐骨神經細胞懸浮于1:2000稀釋的P0單克隆的抗體(P07)中,置冰浴20-25min,經離心漂洗后,再與藻紅蛋白偶聯的抗小鼠IgG1二抗反應。細胞經離心漂洗后,再與偶聯熒光素的抗P75IgG抗體(192)反應,細胞經漂洗后,用含有2ug/ml7-氨基放線菌素D(7-AAD)的培養基進行活細胞染色。

    采用流式細胞儀分選出P75+/P0-的細胞。

    細胞接種于用多聚D-賴氨酸和0.15mg/ml人纖黏連蛋白包被的6孔培養板,加入生長培養基2ml,置37℃含6%CO2及飽和濕度的培養箱中培養。

    在上述培養系統中,分離的細胞在4天之后經特異免疫染色,可見有外周神經元、施萬細胞和平滑肌樣的肌纖維母細胞。P75+的細胞具有多向分化的潛能,但若p0蛋白表達也為陽性的細胞則多向分化的能力降低,而p75-/p0+的細胞則只能分化成施萬細胞和肌纖維母細胞,p75-/p0-的細胞只能分化成肌纖維母細胞。因此要從坐骨神經獲得神經嵴干細胞必須分選p75+的細胞。在培養時使用16nmol/L BMP2,能加速神經元的分化并增加神經元的比例。若使用1nmol/L膠質細胞生長因子(NRG1),在培養14天后,95%以上細胞分化為施萬細胞,而未見有神經元的存在。而若使用TGF-β,細胞的存在能力欠佳,但存活的細胞中SMA陽性的肌纖維母細胞比例很高。


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