天差地別！CRISPR導致的DNA斷裂后修復與理論差距巨大

　　盡管世人對CRISPR-Cas9基因編輯抱有很高期望，科學家們仍對其人體臨床應用持懷疑態度。為什么呢？

　　“基因編輯非常強大，但是到目前為止還有許多問題和錯誤需要探索。它們的工作方式就像一個黑匣子，有許多猜想和假設，”加州大學伯克利分校分子生物學教授Jacob Corn說。“現在，我們終于有能力開始描繪這里面究竟發生了什么。”

　　已知CRISPR-Cas9在每種細胞中的成功率有所不同，這篇發表在《Nature Genetics》的新文章揭示了讓CRISPR-Cas9在幾乎所有細胞中都能更好地發揮作用的隱秘途徑。“如果你想治療鐮狀細胞性貧血，治療成功率與用正確的基因替換原來突變的基因的效率密不可分，”加州大學伯克利分校博后研究員Chris Richardson說。“現在你從病人體內收集了100萬個細胞，正確插入率是10%。如果我們能將其提高到30-40%，效果可想而知。操縱這些細胞提高插入頻率的進程被稱為同源定向修復（homology-directed repair）。”

　　CRISPR依賴DNA修復

　　CRISPR-Cas9是革命性的，它可以在含有成千上萬基因的基因組中精確地切割指定DNA雙鏈，伴隨著切割工作的是細胞損傷修復。

　　修復一般通過兩種方式：在酶的幫助下把兩個懸空的末端粘合，通常這會導致1個或多個堿基的增加或刪除，這會破壞基因功能；另一些酶可以用一段DNA單鏈匹配被剪切的DNA片段的上游和下游序列，建立互補DNA鏈完成雙鏈修復。前者被稱為非同源末端連接，是CRISPR切割導致的最常見情況。后者被稱為同源定向修復，發生的頻率似乎根據不同細胞類型具有選擇性傾向。過去，研究人員試圖通過額外補充一條DNA單鏈來增加細胞利用同源定向修復機制替換錯誤序列。

　　總的來說，這兩個過程都有點神秘，沒人知道細胞為啥“挑三揀四”。“CRISPR-Cas9對合成生物學和醫學來說都是革命性的，但目前還沒人知道把它放入細胞后真正會發生什么，”Richardson說。“我們只知道創建一些斷口，剩下的依靠細胞自己修復它們，我們并沒有真正理解過這一過程是如何運作的。”

　　為了找出哪種DNA修復酶在CRISPR切割后的同源定向修復中起主導作用，Richardson和同事采用了CRISPR干擾技術（CRISPRi），逐個敲除健康細胞的超過2000個已知或疑似參與了DNA修復的基因。

　　令人驚訝的是，許多已知的對同源定向修復比較重要的基因實際上竟然參與的是其他修復系統——

　　這條途徑涉及了21個獨立的蛋白質，人稱范康尼貧血（Fanconi anemia）途徑，因為這條途徑上任何蛋白編碼基因突變都會導致范康尼貧血癥，這是一種罕見的嚴重遺傳性疾病，患者骨髓不能生產足夠的新血細胞。這種出生缺陷還與生命后期的癌癥高風險有關，童年時期患白血病的風險高達10%，很少有病人活過30歲。

　　這條途徑實際上已被科學家們認識幾十年了，它被理解為專門用于修復特定DNA損傷：DNA鏈間交聯（DNA interstrand crosslinks），其中一條DNA鏈的核苷酸與相鄰鏈的核苷酸緊密結合，干擾DNA復制，對細胞來說通常是致命的。

　　20世紀80年代曾有科研人員報道過同源定向修復與范康尼貧血途徑之間存在聯系，很可惜，這些發現一直被忽視或誤解了。

　　“根據我們的研究，范康尼貧血途徑在修復其他損傷中也扮演重要角色，我們最好將它視為能修復雙鏈斷裂的一種途徑，”Richardson說。“在Cas9編輯后，如果你想順利插入新DNA，范康尼貧血途徑是必須的。”

　　范康尼貧血途徑在修復CRISPR斷裂中的重要性使科學家們開始懷疑一些CRISPR疾病治療方案：如果范康尼貧血途徑缺乏活力，這些細胞就無法順利完成用新基因替換突變基因的任務。

　　事實上，范康尼貧血途徑的活性水平可能影響CRISPR在特定細胞中插入DNA的效率。研究人員認為，末端連接是雙鏈斷裂后的默認修復機制，范康尼貧血途徑會與之競爭，如果活性較高的話會導致同源定向修復多于末端連接修復。

　　癌癥治療

　　這些發現幫助科學家更好地理解了人類細胞中的DNA修復機制，同樣，也可以幫助癌癥研究學者指定更好的抗癌策略。現在，人們已經找到了其他影響雙鏈斷裂損傷修復的關鍵因子，我們就可以從這些薄弱的蛋白質入手，阻止癌細胞DNA修復，使它們更容易死亡。

　　Richardson發現，該途徑中的FANCD2蛋白總喜歡在CRISPR-Cas9導致的雙鏈斷裂位點上駐留，這表明它可能對插入新DNA起重要作用。操縱FANCD2可以提高細胞利用同源定向修復的頻率。

　　“鑒于FANCD2的定位，你可以利用它映射Cas9在任何細胞類型中的切割位置，”Richardson說。“如果你正在編輯一群細胞，你肯定很想知道你的目標切割位點在哪，如今，你只需在基因組中找到FANCD2，你就可以找到那些切割位點。”

　　“由21種蛋白質構成的范康尼貧血途徑影響著末端連接和同源定向修復之間的平衡，它就像一個交警，換句話說，患者的基因型將直接影響你應該如何對Ta進行基因編輯，”Corn說。