實驗概要
夾心 ELISA 的一般程序。
實驗原理
夾心 ELISA 測定兩層抗體（即捕獲抗體和檢測抗體）間的抗原數。要測定的抗原必須包含至少兩個能夠結合到抗體的抗原位點，因為至少兩個抗體在夾心中起作用。
單克隆或多克隆抗體均可在夾心 ELISA 系統中用作捕獲抗體和檢測抗體。單克隆抗體識別單一表位，可對抗原中微小差別進行精細檢測和定量。多克隆抗體通常用作捕獲抗體以沉降盡可能多的抗原。
夾心 ELISA 的優點是不必在分析前純化樣品，并且測定非常靈敏（靈敏度比直接或間接 ELISA 高 2 至 5 倍）。
實驗步驟
1. 用捕獲抗體包被
1) 用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6) 中濃度為 1-10 μg/ml 的捕獲抗體包被 PVC 微量滴定板的孔。
如果使用未純化抗體（例如腹水液或抗血清），可能需要通過增加樣品蛋白質的濃度（嘗試用 10 μg/ml）補償較低量的特異性抗體。 |
2) 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在 4℃下孵育過夜。
3) 棄去包被液，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBS。在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴。
2. 封閉和加樣
1) 每孔添加 200μl 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。
2) 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少 1-2 小時，或如更方便的話，則在 4℃下孵育過夜。
3) 將 100 μl 適當稀釋的樣品添加到每個孔。要得到準確的定量結果，通常做法是比較未知樣品與標準曲線的信號。每個酶標板都必須測定標準品（兩重測定或三重測定）和空白樣，以確保準確性。在 37℃下孵育 90 分鐘。
為了進行定量，所用標準品濃度應涵蓋抗體結合的大部分動態檢測范圍。可能需要優化濃度范圍以確保獲得合適的標準曲線。為了進行精確定量，通常樣品和標準品采取兩重測定或三重測定。 |
4) 棄去樣品，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBS。
3. 用檢測抗體孵育，然后用二抗孵育。
1) 將 100 μl 稀釋的檢測抗體添加到每個孔。
確保檢測抗體識別與包被的捕獲抗體有所差別的靶蛋白表位。這可以防止對抗體結合的干擾，并且確保檢測抗體的表位可用于結合。盡可能使用已測試的成對匹配抗體。 |
2) 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 2 小時。
3) 用 PBS 洗滌微量滴定板四次。
4) 添加 100 μl 偶聯二抗，其在使用前便已在封閉緩沖液中稀釋成最佳濃度（依照制造商說明書）。
5) 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 1-2 小時。
6) 用 PBS 洗滌微量滴定板四次。
4. 檢測
雖然有許多不同類型的酶可用作檢測，但是辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (ALP) 是 ELISA 測定中最廣泛使用的兩種酶。某些生物材料具有高水平內源酶活性（例如肺泡細胞中的高水平 ALP、紅細胞中的高水平過氧化物酶），考慮到這一事實是非常重要的，這可能會導致非特異性信號。如有必要，用左旋咪唑（針對 ALP）或用 0.3% H2O2 的甲醇溶液（針對過氧化物酶）進行另外的阻斷處理。
5. ALP 底物
對于大多數應用，pNPP（對硝基苯磷酸鹽）是最常用的底物。在室溫下孵育 15-30 分鐘后，可在 405 nm 處測定硝基苯酚呈現的黃色。（該反應可通過添加等體積的 0.75 M NaOH 終止）。
6. HRP 顯色液
HRP 的底物為過氧化氫。過氧化氫的裂解與氫供體的氧化偶聯，反應期間氫供體的氧化使顏色發生變化。
7. TMB (3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)
將 TMB 溶液添加到每個孔，孵育 15-30 分鐘，添加等體積的終止液 (2 M H2SO4)，然后在 450 nm 處讀取光密度。
8. OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)
在 492 nm 下測定終產物。注意底物對光敏感，應將它存放在暗處。
9. ABTS (2,2’-聯氮-雙-[3-乙基-苯并噻唑啉-6 磺酸] 二銨鹽)
終產物為綠色，可在 416 nm 處測定光密度。
注意：某些酶底物被認為是有害的（潛在致癌物），因此始終要小心處理并佩戴手套。
1) 使用多道移液器或多檔移液器為每孔分配 100 μl（或 50 μl）底物溶液。
10. 數據分析：
由系列稀釋液得到的數據繪制標準曲線，濃度標在 X 軸（對數標度）上，而吸光度標在 Y 軸（線性標度）上。通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。