1.過氧化氫(H2O2)玻片法(過氧化氫酶試驗法)
大多數活細胞包括白細胞都含有過氧化氫酶,能分解過氧化氫而產生氧。但正常乳中的白細胞少,過氧化氫酶很少;乳房炎時,白細胞增多,故過氧化氫酶也增多,放出的氧也多。
(1)試劑。取雙氧水(30% H2O2),按1:(2.33~4)的比例加入中性蒸餾水,配成6%~9%過氧化氫試劑待用。
(2)方法。將載玻片置于白色襯墊物上,滴被檢乳3滴,再加過氧化氫試劑1滴,混合均勻,靜置2min后觀察。
(3)判定標準見下表。
被檢乳 | 反應 | 判定符號 |
陰性乳 | 液面中心無氣泡,或有小如針尖的氣泡聚集 | - |
可疑乳 | 液面中心有少量大如粟粒的氣泡聚集 | ± |
感染乳 | 液面中心布滿或有大量大如粟粒的氣泡聚集 | + |
2.氫氧化鈉凝乳檢驗法
正常乳加藥后無變化,有乳房炎的乳汁,混合后變黏稠或變為絮片。但不適用于初乳及末期乳的檢驗。
(1)試劑。4%苛性鈉溶液。
(2)方法。將載玻片置于黑色襯墊物上,先加被檢乳5滴,再加試劑2滴,用細玻棒或火柴桿迅速將其擴展成直徑2. 5cm的圓形,并繼續攪20s,觀察。如乳樣事先經冷藏保存,則只加試劑一滴。
(3)判定標準,見下表。
被檢乳 | 乳汁反應 | 判定符號 | 推算細胞總數 |
陰性 | 無變化,無凝乳 | - | 50以下 |
可疑 | 出現細小凝乳塊 | ± | 50-100 |
弱陽性 | 有較大凝乳塊,乳汁略微透明 | + | 100-200 |
陽性 | 乳凝塊大,攪拌混合時有絲狀凝結物形成,全乳略成水樣透明 | ++ | 200以上 |
強陽性 | 大凝塊,有時全部形成凝塊,完全透明 | +++ | 500- 600 |
3.溴麝香草酚藍(B.T.B)檢驗法
是一種較簡單常用的方法,測定乳汁的pH變化。健康牛乳呈弱酸性,pH為6.0~6.5;乳房炎乳為堿性,其pH升高的程度依炎癥的輕重而不同。
(1)試劑。47. 4%酒精500mL加B.T. B1g,再加5%苛性鈉溶液1.3~1.5mL,三者混合均勻,試劑呈微綠色。如偏酸時,滴碳酸氫鈉液;如偏堿時,滴加鹽酸,校正成中性。
(2)方法。
試管法:首先在10mL試管中加入B.T.B試劑1mL,再加入被檢乳5mL,混合均勻后靜置1min觀察。或者首先在10mL試管中加入被檢乳5mL,然后用2mL吸管吸取B.T.B試劑1mL,沿試管壁緩慢滴入被檢乳中,觀察被檢乳與試劑接觸的變化。
玻片法:將載玻片置于白色襯墊物上,滴被檢乳1滴,再加B.T.B試劑一滴,混合觀察。
(3)判定標準,見下表。
被檢乳 | 顏色反應 | pH | 判定符號 |
陰性乳 | 黃綠色 | 6-6.5 | - |
可疑乳 | 綠色 | 6.6 | ± |
感染乳 | 藍綠或青綠 | 6.6以上 | + |
4.烷基硫酸鹽(C.M.T)檢驗法
是通過測定DNA的量來估測乳中白細胞數的方法。試劑是一種陽離子表面活性劑(如烷基丙烯硫酸鈉)和一種指示劑(溴甲酚紫),但對初乳期和末期的牛乳不適用。
(1)試劑。苛性鈉159,烷基硫酸鈉30~50g(烷基硫酸鉀、烷基烯丙基硫酸鈉、烷基丙烯硫酸鉀亦可代用),溴甲酚紫(B.C.P)0.1g,蒸餾水1000mL,混合為溶液。
(2)方法。先將被檢乳2mL,置于深1.5cm、直徑5cm的乳白色塑料皿中,再加入試劑2mL,緩慢做同心圓攪拌l5s,觀察結果。
(3)判定標準,見下表。
被檢乳 | 乳汁反應 | 判定符號 |
陰性 | 液狀無變化 | - |
可疑 | 有微量沉淀物,但不久即消失 | ± |
弱陽性 | 部分形成凝膠沉淀物 | + |
陽性 | 全部形成凝膠物,回轉攪動向心集中,停止攪動則呈凹凸狀覆著皿底 | ++ |
強陽性 | 全部形成凝膠物,回轉攪動向心集中,停止攪動則恢復原狀,覆著皿底 | +++ |
酸性乳 | 由于乳酸分解,液體呈黃色 | 酸性乳 |
堿性乳 | 呈深黃色,為接近干乳期,感染乳房炎,泌乳量降低的現象 | 堿性乳 |
四、注意事項
(1)奶樣應保持新鮮,如采集時間已久,即使冷藏保存也可能變質而影響檢驗結果,特別是B.T.B檢驗法,對奶樣的要求更加嚴格,乳汁pH發生變化,判斷的結果則不準確。最好現場操作。
(2)配制試劑的各藥品均應為化學純的,所用的各種器皿(試管、吸管、塑料平皿等)用前均須用中性蒸餾水沖洗干凈,否則會影響準確性。
(3)為了增加學生操作機會及熟悉各種不同奶樣(正常的、感染的)的反應現象,可根據實習時間,盡可能收集足夠數量和質量的奶樣,以便進行對照檢驗。