(1)粗提
①試劑
a.1倍 CTAB 提取緩沖液:2倍 CTAB 貯存液稀釋1倍,使用前每100mL 加入巰基乙醇0.14mL。
b.其他試劑與從新鮮材料中提取相同。
②操作
a.稱取 1g 干燥材料置研缽中,加入3~4g 鋁粉研磨。
b.將粉末轉入離心管中,加入0.6~15mL 1倍 CTAB 提取緩沖液,輕緩地攪拌,使材料充分分散。置56℃水浴中保溫10~20min。
c.冷卻至室溫,加入等體積氯仿/異戊醇,顛倒離心管混勻。20℃、8000離心力離心10min。
d.將上相轉入另一離心管中,加入0.1體積的10% CTAB 溶液,輕輕混合,重復c,d操作。
e.加入等體積的1倍 CTAB 沉淀緩沖液輕輕混勻,室溫下放置 30min 或更長。
f.室溫條件下,1500離心力離心10min,去上清液,沉淀純化。
(2)粗提物的純化
①小量制備物的純化
試劑
a.Imol/L NaCl。
b.65%,80%無水乙醇。
操作
a.將沉淀溶于 400L 1mol/L NaCl 中可置56℃水浴中助溶。
b.加入2倍體積的無水乙醇,于一70沉淀30min,或20℃過夜。
c.15000r/min 離心2min。去上清液。
d.先后用65%,80%乙醇,漂洗沉淀,吹干,溶于無菌蒸餾水中。
②大量制備物的純化
試劑
a.1mol/L CsCl/EB溶液:50mmol/L Tris·Cl(pH8.0),10 mmol/L EDTA,1 mol/L CsCl,0.2mg/mL EB。
b.7mol/L CSCl/EB 溶液:7mol/L CsCl,0.1%sarkosyl,0.2mg/mL EB。
操作
a.向沉淀加入 2.4mmol/L CsCl/EB 溶液,于56℃水浴中溶解。
b.將溶液轉入到 Beckman VTi65 超速離心管(或其他可替代的離心管)中,加入2.9mL7mol/L CsCl/EB 溶液,平衡,密封管口,輕輕倒置混合。
c.用 VTi65 轉子58000r/min 離心4h,或40000r/min 離心16h。
d.320nm 紫外光照射下觀察 DNA 的紅色帶,用16號針頭的1mL 注射器從離心管側面穿刺抽取 DNA。
e.用 CsCl 飽和的異丙醇反復抽提 DNA,至抽提液無明顯紅色(去除EB)。
f.將 DNA 樣品置透析袋中,于4℃蒸餾水中透析24h,其間更換蒸餾水3~4次。
g.透析液轉入離心管中,加入1/10體積的3mol 二乙酸鈉,及2倍體積的冷乙醇,混勻,于20℃沉淀過夜(或-70℃放置30min)。
h.80000離心力離心15min,去上清液真空干燥 DNA 沉淀。用適量的 TE 溶解。