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  • 發布時間:2019-04-29 13:56 原文鏈接: 如何使昆蟲細胞適應新的培養液

    市場上供應的大多數培養液的配方非常接近,這使得細胞很容易適應新的培養液。這里我將詳細介紹一個方法,這個方法是保守的,在大多數情況下可以進行刪減一些步驟。最簡單最節省時間的情況是把細胞直接分裝到新的培養液中,觀察幾代以保證細胞的生長參數是可以接受的。這個方法適于懸浮細胞,不過也很容易擴展到貼壁細胞。

    細胞的生長參數

    1.翻倍時間(Doubling Time)

    細胞的翻倍時間在評價昆蟲細胞健康程度的參數中是最容易測量的。翻倍時間應該在細胞處于對數期復制時測量,對于Sf9和Sf21細胞來說通常是介于16-24小時之間,不過大多數在20-22小時。

    dt=t×ln2/ln(Ct/Co),其中dt為翻倍時間,Co為起始細胞數目,Ct為經過時間t后的細胞數目,t為Co和Ct兩次計數之間的間隔時間,所有的時間都以小時為單位。

    2.細胞大小(Cell Size)

    細胞的大小是監測細胞健康程度的一個非常有用的參數。如果細胞是健康的,細胞的大小均一,都處于該細胞株體積正常變化范圍的下限。細胞的大小在不同的細胞株變化是很大的。對于我用過的Sf9和Sf21,典型的直徑是16-18mm,不過我知道有些細胞株小至14 mm或者大至19 mm仍然很健康。

    3.滯后期(Duration of Lag)

    當細胞的密度較低時,會有一個滯后期,其長短取決于分裝或者傳代后細胞的密度。一般說來,該密度越低,滯后期越長。對于一個特定的細胞株來說,當這個密度高出一個閾值時,滯后期的長短與密度無關;而低于一個閾值時,滯后期無限長,細胞不再增殖。

    4.低密度分裝極限(Low Density Split Tolerance)

    能夠在一個較短的滯后期(小于12小時)復蘇的細胞形狀較好。不過這是細胞株的特性,需要進行實驗來確定你的細胞株的密度極限。我的細胞株有些在分裝成密度為5×104細胞/ml時仍然可以很好復蘇,有些細胞株分裝成5×105細胞/ml就不能復蘇了。

    5.高密度極限(High Density Maximum)

    這是你的細胞能生長的最大密度,高于這個密度你的細胞將進入平臺期。這個指標既和細胞株有關,又和使用的培養液有關。我建議先把你的細胞株培養至平臺期,然后把一些分裝到新鮮的培養液中以后,使剩下的繼續生長至平臺期,同時密切監測細胞狀況。一般來說,細胞的培養要避免密度超過高密度極限的80%。對于我培養的細胞,這個極限值從2×106至12×106細胞/ml不等。

    實驗步驟

    第一階段:

    1.準備合適體積的由25%體積新培養液和75%舊培養液(即細胞原先適應的培養液)組成的混合培養液I。

    2.將細胞以通常分裝時使用的最低分裝密度的兩倍分裝到混合培養液I中。

    3.使細胞生長到通常培養時的較高密度,監測細胞生長參數。

    4.繼續以步驟2中的密度分裝細胞到新鮮的混合培養液I中,直到生長參數達到可以接受的水平。有時候分裝一次就可達到要求。

    5.一旦細胞穩定下來,以通常使用的最低分裝密度分裝細胞至新鮮的混合培養液I中,同樣監測細胞參數。

    6.細胞達到較高密度后,繼續以步驟5中的分裝密度把細胞分裝到新鮮的混合培養液I中,直到細胞的生長參數達到可以接受的水平。

    7.如果細胞恢復到正常狀態,進行第二階段的實驗。

    8.如果細胞不能達到正常狀態,新培養液可能不適于培養這種細胞。

    9.如果細胞在新培養液中的生長參數達到平衡狀態,雖然與正常狀態不同,但是可以為實驗接受,也可進行第二階段的實驗。

    第二階段:

    1.準備適量的由50%新培養液和50%舊培養液組成的混合培養液II。

    2.將細胞以兩倍最低分裝密度分裝至混合培養液II中。

    3.如第一階段一樣,監測細胞生長指數,使細胞達到穩定狀態。然后將分裝密度降到最低分裝密度,再使細胞達到穩定狀態。

    第三階段:

    步驟同第一階段和第二階段,使細胞適應混合培養液III(75%新培養液和25%舊培養液)。

    第四階段:

    1.步驟同第一階段、第二階段和第三階段,使細胞適應新培養液。

    2.當細胞在新培養液中達到穩定后,監測細胞的生長指數,看是否波動過大。


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