結果
SoftMax Pro軟件中預置的IMAP
熒光偏振模板會自動計算出水平偏振均值和垂直偏振均值(mP值)，總的熒光強度，標準方差和CV值。每一組試驗樣品的組群一欄中，模板會自動扣除背景樣品的熒光偏振值，然后計算出最小偏振mP值。也可根據相應的校正曲線計算出樣品磷酸化比率。(See
IMAP Application Note #4, “Developing calibration curves for IMAP”)
圖表2顯示了使用 FAM-p34cdc2多肽獲得的一條LCK激酶的稀釋度曲線。當用SpectraMax
M5微孔板讀板機檢測時，得出酶的濃度范圍從0.04至3.5
units/ml，最小偏振值為303，同時Z'因子的值為0.87。圖表3顯示了使用Analyst
HT多功能讀微孔板讀板機檢測相同孔時，熒光偏振值為336，Z'因子的值為0.95。兩臺儀器得到的EC50值均為0.5 units/ml。
如果使用非磷酸化和磷酸化的多肽樣品作為質控分別做一條校正曲線，可以將熒光偏振值以百分比形式顯示，得出其磷酸化程度。(See Figure 4.)首先建立一條新的曲線(軟件默認名稱為Graph#1)，分別使用熒光偏振值(mP值)相對磷酸化百分比(濃度)作為你的質控樣品組繪制一條曲線。曲線默認名稱為“Plot#1.”在校正標準品組欄里，新建一列后輸入下面的公式，即：
InterpX(‘Plot#1@ Graph#1@IMAP FP_FAM’,AvgbkgsubmP)。并用‘IMAP FP_FAM’作為試驗名稱。
為了確定使用紅色熒光染料進行IMAP激酶試驗的效果，另一個LCK激酶稀釋曲線結果的獲得來源于TAMRA-p34cdc2多肽。(See
Figure 5.)使用SpectraMax M5微孔板讀板機檢測結果，酶的濃度范圍是從0.04到3.5
units/ml，熒光偏振值(mP值)為258 ， 同時Z ' 因子的值為0.95 。在Figure 6中，相同的試驗使用Analyst
HT微孔板讀板機進行檢測后，熒光偏振值(mP值)結果為270，同時Z'因子的值為0.93。兩個讀板機得到的EC50值都為0.4units/ml，與FAM標記的底物獲得結果相一致。同樣也建立了一條相關的校正曲線(See
Figure 7.)，TAMRA和FAM相近的結果也可以讓用戶利用紅色熒光染料給我們帶來的優勢，即能夠盡可能降低化合物產生的背景熒光。
總結
隨著研究人員努力去探究激酶在細胞信號轉導通路和各種疾病中扮演的角色，以及在許多疾病治療中發揮的調節機制，他們越來越希望獲得非放射性的、均相的檢測方法，可用于試驗優化和高通量藥物的篩選。熒光偏振試驗可提供一種均相的、高通量的方式來鑒定各種激酶的激活劑、抑制劑和底物。使用SpectraMax M5多功能微孔板讀板機進行IMAP熒光偏振檢測：獲得的結果精確性高、重復好、Z'因子值高，雙光柵型單色器系統方便使用者選擇不同熒光染料標記的多肽底物進行試驗優化，而無需額外的在選購濾光片。此外，無論是用綠色或者紅色熒光染料標記的底物進行IMAP熒光偏振激酶試驗，獲得的結果都與使用濾光片型單色器的微孔板讀板機上的檢測值相一致。最后，SoftMax Pro軟件上預設的IMAP 熒光偏振模板為熒光偏振數據的采集和分析提供了一種更為方便的方式，并且這些模板也可用于不同熒光染料分子的檢測。
參考
1.IMAP Akt Assay Kit Product Insert(Molecular Devices product #R8058).
2.Developing calibration curves for IMAP(IMAP Application Note #4).
3.Zhang, J.H., Chung, T.D.Y., and Oldenburg,K.R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of highthroughput screening assays. J Biomol Screen 4 (2): 67-73.