如何減少westernblot非特異性條帶的產生？

非特異性條帶？

沒有什么比以多個條帶結束你的western blot實驗更令人沮喪。 這是我的樣品嗎？ 封閉液的問題？ 抗體的問題？ 如果您正在使用新的樣本或抗體，答案可能是，也不確定。 通過一次更改一個變量，對Western進行故障排除是一個痛苦的過程。 我們不能完全地讓你所有的問題都消失，但這里有一些提示可以幫助你提高你的印跡質量。

樣品的問題？

樣品質量差是多個條帶的主要來源。 以下是蛋白樣本可能出現的一些常見問題。

• 如果您觀察到多個條帶在預期分子量下，您的蛋白質很可能已經降解。 確保在蛋白質提取過程中添加蛋白酶抑制劑并保持樣品低溫狀態。

• 如果條帶大于預期分子量，請檢查文獻中的磷酸化，糖基化，乙酰化或甲基化等修飾，將蛋白放在更大尺寸的膠中進行跑膠。

• 如果到處都有條帶，您可能加載了過多的樣品，這些樣品會導致對無關的裂解蛋白非特異性吸附。 在樣品制備方面，不要忘記在上樣前加熱到至少60°C使樣品變性。

• 您的目的蛋白可能與其他蛋白共享表位。 要進行檢查，請運行BLAST搜索以查看目的蛋白的唯一性。

• 另一種可能性是，細胞系中的蛋白質表達隨著時間的推移而逐漸消失。 如果可以的話，重新開始使用新的非傳代細胞。

封閉液的問題？

使用錯誤的封閉緩沖液會給你的印跡帶來災難。 許多常用的封閉緩沖液可以掩蓋目標上的表位，使其難以檢測。 或者是封閉無效產生非特異性結合。


一抗和二抗的問題？

一抗和二抗也會產生麻煩。 在選擇一抗時，通常有很多選擇。 為獲得最佳結果，請選擇經過親和純化并根據您的應用進行驗證的抗體。 親和純化從制劑中消除了大量非特異性免疫球蛋白，產生更干凈的印跡。