如何利用LAMP引物設計平臺設計IMSA引物？1

IMSA，全稱為isothermal multiple-self-matching-initiated amplification，中文名為等溫多自配引發擴增。該技術的詳細介紹可見本公眾號歷史文章：“分子診斷萬花筒” 開篇——等溫多自配引發擴增技術簡介。在這里隆地熊為大家介紹一種如何利用LAMP引物設計平臺去設計IMSA引物的方法。

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在進行引物設計前，通過比對軟件獲得所測基因的保守序列是必不可少的前提。這樣做的目的是排除物種特異性，防止交叉反應。如何獲得基因的保守序列，具體操作可見“分子診斷萬花筒”小白篇——如何設計PCR引物（一）。

     當獲得保守序列后，可以利用LAMP引物設計平臺進行IMSA引物設計。當然，也可以根據IMSA引物設計的原理，利用PCR引物設計軟件進行設計。但個人建議選擇前者。為了方便闡述，本文以設計針對EV71VP1基因檢測的引物作為例子。

1. 建立EV71VP1 gene.txt文件，將所獲得的保守序列復制粘貼到其中。

2. 打開LAMP引物設計平臺（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）并上傳導入EV71 VP1 gene.txt文件。

3. 無需做ParameterSet，直接點擊Primer Design并進入引物設計界面。

4. 當直接點擊Generate時，平臺只提供了一套系統默認的LAMP引物。數量過少顯然滿足不了IMSA引物設計。此時，需要點擊DetailSetting以獲得更多套LAMP引物。

5. 點擊DetailSetting后，再點擊Generate，平臺可提供的LAMP引物增加到25套。然而，當點擊Display時，所呈現的引物實際上是同一類引物，因為F1c和B1c的位點幾乎一致。

Tip 1: 利用LAMP引物平臺來設計IMSA引物的重中之重就是尋找F1c和B1c位點可高度重疊（即完全互補）的不同引物組合，還要兼顧每套引物能不能設計出所需的環引物來。