如何制作標準曲線？

你在實驗過程中是不是也經常會遇到這個問題：標曲的相關系數達不到“4個9”，甚至根本不成線性。根本原因是的標準曲線做的不規范，那么，什么是規范的標準曲線自作方法呢?

在學習制作標準曲線此之前，我們要了解一個重要前提，那就是：制作標準曲線的要求是什么?只有知道要求，我們才能按照要求制作出合格的標準曲線。

制作要求

按GB/T22554-2010《基于標準樣品的線性校準》推薦：

1、標準曲線的濃度范圍應覆蓋正常操作條件下的被測量范圍;

2、標準樣品的組分盡量與被測樣品組分一致;

3、標準樣品的濃度值應等距離的分布在被測量范圍;

4、標準樣品的個數至少應有3個濃度;

5、每個標準點至少重復2次，這個重復是指從稀釋開始;

如果國家標準有相應的濃度系列推薦，盡量按國家標準，如果你要偷懶，比如我要減少標準點，至少要有理論標準支撐，比如至少要3個濃度。工作中我們經常采用線性校準，因為線性方程最為簡潔。

制作方法

1.標準液濃度的選擇：

在制備標準曲線時，標準液濃度選擇一般應能包括待測樣品的可能變異最低與最高值，一般可選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級增加，并應與被測液同樣條件下顯色測定。

2.標準液的測定：

在比色時，讀取光密度至少讀2-3次，求其平均值，以減少儀器不穩定而產生的誤差。

3.標準曲線圖的繪制：

一般常用的是光密度--濃度標準曲線。

①用普通方格紙作圖。圖紙最好是正方形(長：寬=l：1)或長方形(長：寬=3 ：2)，以橫軸為濃度，縱軸為光密度，一般濃度的全距占用了多少格，光密度的全距也應占用相同的格數。

在適當范圍內配制各種不同濃度的標準液，求其光密度，繪制標準曲線，以濃度位置向上延長，光密度位置向右延長、交點即為此座標標點。然后，將各坐標點和原點聯成一條線，若符合Lambert-Beer氏定律，則系通過原點的直線。

②若各點不在一直線，則可通過原點，盡可能使直線通過更多點，使不在直線上的點盡量均勻地分布在直線的兩邊。

③標準曲線繪制完畢以后，應在座標紙上注明實驗項目的名稱，所使用比色計的型號和儀器編號、濾光片號碼或單色光波長以及繪制的日期、室溫。

④繪制標準曲線：一般應作二次或三次以上的平行測定，重復性良好曲線方可應用。

⑤繪制好的標準曲線只能供以后在相同條件下操作測定相同物質時使用。當更換儀器、移動儀器位置、調換試劑及室溫有明顯改變時，標準曲線需重新繪制。

⑥標準曲線橫坐標的標度：從標準液的含量換算成待測液的濃度。

注意事項

對于分析定量來說，如果標線沒有做好，那么即使前處理做的再好，回收率再好，也會使你的結論失去一定的參考價值!也失去了與其他人員測試數據的可比性!要做好定量工作除了儀器正常外，我們也要配制好一條好的標線：

1.首先盡量選取有證書的標準物質

不管是直接要用的母液還是要配置成母液的其他物質(如固體，粉末等)!選取有證書的標準物質是為了大家都有一個共同的基準(量值溯源)!如果實在是在沒有有證書的母液條件下，就用有證書的其他物質來配置!如果有就最好用有證書的物質，因為自己配置的母液會帶來一定的誤差!

2.需用經過計量部門校正的器具

在配置時要把所有要用到的工具(容量瓶、移液槍、移液管等)進行校正，最好拿到國家計量中心或有資質的部門校正!有校正能力的實驗室也可自己校正!

3.防止污染

要洗凈所要用到的工具!對于離子色譜來說，主要使用去離子水清洗!

4.配制好標液后，及時上機

避免有的物質不穩定或易被污染，但在常規實驗室中也只有常規分析的時候，相對比較容易些，而現目前不少實驗項目均要求檢測ppb級含量的物質，IC是很容易引入污染的(Cl、Na等)。跨越幾個數量級時，線性系數雖然很好，但是RSD值卻很大，痕量分析的定量誤差是相當的大。

5.選取合適的方程

根據物質的和檢測器的特性，選取合適的線性方程。(比如是否要強制過原點，是直線還是二次方程等)

6.檢查線性是否合格

除線性本身的一些參數：RSD值是否小于一定值比如(5%)，線性相關系數是否達到比如四個九以上，如果不是強行過原點的一次方程的節距是否合理等外，還要檢查濃度的準確性，因為一定濃度的母液，按一定比例稀釋都可成一定線性的，但濃度就不一定就是所需要的!所以光看線性好，是不能代表所做的標線就是合格的。

7.標線的準確性除儀器自身的回收率、響應值等相關外，另外我們可以做到：

⑴不同的人員配置標線和QC;

⑵防止母液是否有問題，要做標液的新舊對比或者不同的牌子的有證標準物質(參考物質)進行監控和或使用或次級標準物質(參考物質)開展內部質量控制;

⑶參加實驗室間的比對或能力驗證;

⑷使用相同或不同方法進行重復檢測或校準;

⑸對存留物品進行再檢測或再校準

8.標線使用壽命確認

合格后，還要通過QC等觀察標線的使用壽命!

常見問題

1.標準曲線需要人為的增加(0,0)點嗎?

不能。通常的標準系列多是配制0,1,2,3mg/L系列這樣的說法，沒做實驗人為添加(0,0)很不妥，因為很多時候0管進入儀器可能也有響應值，這也是我們考察試劑空白的一個重要步驟。這個0管在某些時候非常重要，比如全血鉛測定，我們采用牛血清來基體匹配標準系列，如果此時你用酸做空白或沒做實驗人為添加(0,0)，那你就很難做好標準曲線。所以標準曲線的0管也是做好標準曲線的重要考慮點。

2.標準曲線需要減掉試劑空白來做嗎?

不需要。儀器測出來標準系列的響應值可以減掉試劑空白或減掉0管的響應值來做，工作中我們也常用0管來做儀器調零。其實沒有必要那么麻煩，即使空白或0管有響應值，在構建標準曲線時，我們已經認為該響應值就是0濃度，也就是扣除了這個空白的。

3.什么時候用Y=bX和二次曲線呢?

標準曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統計檢驗，且要做統計完備的線性檢驗和失擬檢驗，然后再做a與0的差別檢驗，如果a與0的統計學上無差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來后同樣做線性檢驗和失擬檢驗，如果線性檢驗合格(P<0.05)且失擬檢驗合格(P>0.05)此時你就可以采用Y=bX。

二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗和失擬檢驗合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統計學上參數最少的統計簡潔性原則。

4.標準曲線去查含量時是先減空白信號算樣品含量還是先算出空白含量相減呢?

工作中我們常要減掉空白得到樣品含量，現有國家標準方法有的推薦先算出空白含量，用樣品含量相減，也有推薦先用樣品信號減空白信號然后去標準曲線推算含量。而且這兩種算法常常差距很大。其實這種差距往往是低含量水平時才出現，在低含量水平通過標準曲線推算含量時，本身不確定度就很大。這兩種方法都可以。

個人推薦先用樣品信號減空白信號然后去標準曲線推算含量，因為這樣出來的含量不確定度要小一些，而先算出空白含量再相減就增加了1次標準曲線推算含量時的不確定度，因為好的測量永遠是不確定度小的測量。

5.標準曲線法和標準加入法區別?

(1)標準曲線法：

也稱外標法或直接比較法，是一種簡便、快速的定量方法。與分光光度分析中的標準曲線法相似，首先用欲測組分的標準樣品繪制標準曲線。

具體方法是：用標準樣品配制成不同濃度的標準系列，在與待測組分相同的色譜條件下，等體積準確進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準曲線，此標準曲線應是通過原點的直線。若標準曲線不通過原點，則說明存在系統誤差。標準曲線的斜率即為絕對校正因子。

在測定樣品中的組分含量時，要用與繪制標準曲線完全相同的色譜條件作出色譜圖，測量色譜峰面積或峰高，然后根據峰面積和峰高在標準曲線上直接查出注入色譜柱中樣品組分的濃度。

標準曲線法的優點是：繪制好標準工作曲線后測定工作就變得相當簡單，可直接從標準工作曲線上讀出含量，因此特別適合于大量樣品的分析。

標準曲線法的缺點是：每次樣品分析的色譜條件(檢測器的響應性能，柱溫，流動相流速及組成，進樣量，柱效等)很難完全相同，因此容易出現較大誤差。此外，標準工作曲線繪制時，一般使用欲測組分的標準樣品(或已知準確含量的樣品)，而實際樣品的組成卻千差萬別，因此必將給測量帶來一定的誤差。

(2)標準加入法，又名標準增量法：

是一種被廣泛使用的檢驗儀器準確度的測試方法。這種方法尤其適用于檢驗樣品中是否存在干擾物質。

具體方法是：將一定量已知濃度的標準溶液加入待測樣品中，測定加入前后樣品的濃度。加入標準溶液后的濃度將比加入前的高，其增加的量應等于加入的標準溶液中所含的待測物質的量。如果樣品中存在干擾物質，則濃度的增加值將小于或大于理論值。

總的來說，標準曲線法適用于標準曲線的基體和樣品的基體大致相同的情況，優點是速度快，缺點是當樣品基體復雜時不正確。標準加入法可以有效克服上面所說的缺點，因為他是把樣品和標準混在一起同時測定的，但他也有缺點就是速度很慢。標準曲線法可在樣品很多的時候使用，先做出曲線，然后從曲線上找點，那樣方便。標準加入法，適合數量 少的時候用。