如何在獼猴桃成熟期間提高乙烯產生及其中間體含量

　　2021年6月16日，New Phytologist在線發表了浙江大學農業與生物技術學院殷學仁教授課題組題為“An ethylene-hypersensitive methionine sulfoxide reductase regulated by NAC transcription factors increases methionine pool size and ethylene production during kiwifruit ripening”的研究論文。該研究發現由NAC轉錄因子AdNAC2和AdNAC72所調控的乙烯響應性甲硫氨酸亞砜還原酶編碼基因AdMsrB1，可在獼猴桃成熟期間提高乙烯產生及其生物合成中間體的含量。

　　研究背景

　　乙烯通過觸發成熟相關基因表達的動態變化，在調節果實成熟中發揮重要作用。在番茄中已有大量的乙烯合成和信號轉導途徑相關基因的功能被發現和鑒定。盡管番茄和多年生水果作物之間有許多相似之處，但最近研究表明，不同水果在乙烯信號或響應的調控方面存在明顯差異。另外，在這些非模式水果作物中還有一些與成熟相關但功能未知的基因。獼猴桃（Actinidia spp.）是一種多年生躍變型水果作物，在成熟過程中產生大量的乙烯，也是乙烯敏感型水果之一。此外，在獼猴桃成熟過程中，果實軟化與內源性躍變乙烯產生速率的上升之間存在明顯分離。因此，獼猴桃是研究果實成熟期間乙烯產生和信號轉導的理想選擇。

　　主要結果

　　1.乙烯過敏性基因AdMsrB1的鑒定

　　為鑒定獼猴桃中的早期乙烯響應基因，對前期經乙烯處理和非處理水果的轉錄組數據進行分析發現，甲硫氨酸亞砜還原酶（methionine sulfoxide reductase）編碼基因AdMsrB1對乙烯表現出超敏反應，其表達水平顯著高于其他響應基因。底物特異性分析顯示，AdMsrB1不存在時，甲硫氨酸亞砜（MetSO）被分成Met-S-SO和Met-R-SO兩種不同的立體異構體，且R型豐度高于S型。當加入AdMsrB1蛋白時，Met-R-SO顯著減少，伴隨Met峰值相應增加，表明MetSO的R對映體是AdMsrB1的首選底物，并被轉換為Met。

　　2.AdMsrB1的穩定過表達增加了獼猴桃葉片中游離Met和ACC的含量

　　為研究AdMsrB1在植物體內的功能，首先獲得了AdMsrB1穩定過表達的東紅獼猴桃株系。乙烯處理分析發現，AdMsrB1過表達株系葉片中游離Met的含量顯著高于對照植株葉片，乙烯生物合成的直接前體ACC（1-氨基環丙烷-1-羧酸）也顯著增加，乙烯釋放量隨之提高（圖1）。

　　圖1. AdMsrB1過表達獼猴桃植株的表型鑒定

　　3.乙烯促進AdMsrB1和響應性轉錄因子AdNAC2和AdNAC72轉錄本的積累

　　AdMsrB1啟動子對乙烯響應的活性檢測結果表明，乙烯處理后AdMsrB1表達水平的增加并不是源于乙烯或乙烯相關轉錄因子對AdMsrB1啟動子的直接調控。進一步通過RNA-seq分析以及雙熒光素酶活性檢測發現，AdMsrB1啟動子活性受乙烯響應性轉錄因子AdNAC2和AdNAC72的顯著誘導。EMSA實驗結果顯示，AdNAC2和AdNAC72與AdMsrB1啟動子直接結合。

　　4.AdNAC72的過表達激活了AdMsrB1表達，并增加了游離Met和ACC含量

　　已知AdNAC2與番茄成熟相關轉錄因子NOR（NON-RIPENING）同源。為深入解析NAC轉錄因子的調控作用，同樣首先獲得了AdNAC72穩定過表達獼猴桃株系。乙烯處理后檢測發現，AdNAC72過表達株系的AdMsrB1轉錄水平顯著升高，葉片中游離Met和AAC含量較對照顯著增加，內源性乙烯的產生也明顯提高（圖2）。此外，獼猴桃愈傷組織中AdNAC2的過表達也顯示AdMsrB1轉錄豐度的增加。

　　圖2. AdNAC72過表達獼猴桃植株的表型分析

　　一圖解文

　　乙烯處理觸發AdNAC2和AdNAC72的表達，它們作為轉錄激活因子通過直接結合AdMsrB1啟動子來上調該基因的表達。AdMsrB1特異性作用于氧化應激誘導產生的甲硫氨酸亞砜（MetSO）的R對映體，將其還原為甲硫氨酸（Met），以增加游離Met和乙烯前體ACC的含量，從而促使乙烯合成的增加和釋放，進而促進果實成熟。

　　圖3.AdMsrB1、AdNAC2和AdNAC72在獼猴桃成熟期間的工作模型