如何提高DNA片段的轉化率

一、克隆分析原理

克隆分析用于將DNA片段從一個載體（質粒、黏粒或噬菌體）轉移到另一個載體上。它們通常用于構建表達系統，或是將DNA片段轉移到特殊的載體上以制備雜交探針或是制備測序用的單鏈模板。典型的載體含有三個必要的元件：一個抗生素抗性標記、一個復制起點（以便選擇轉化了的大腸桿菌宿主）以及一個或多個可供插入外源DNA片段的限制酶切位點。
基本的亞克隆操作包含四步：首先用合適的限制性內切酶切割載體與插入片段，接著用T4DNA連接酶將DNA片段與載體連接，然后轉化宿主大腸桿菌，最后篩選出含有所需結構的重組質粒。

克隆分析用于將DNA片段從一個載體（質粒、黏粒或噬菌體）轉移到另一個載體上。它們通常用于構建表達系統，或是將DNA片段轉移到特殊的載體上以制備雜交探針或是制備測序用的單鏈模板。典型的載體含有三個必要的元件：一個抗生素抗性標記、一個復制起點（以便選擇轉化了的大腸桿菌宿主）以及一個或多個可供插入外源DNA片段的限制酶切位點。
基本的亞克隆操作包含四步：首先用合適的限制性內切酶切割載體與插入片段，接著用T4DNA連接酶將DNA片段與載體連接，然后轉化宿主大腸桿菌，最后篩選出含有所需結構的重組質粒。
連接僅僅包含兩段線型DNA分子的連接，通常形成環狀的重組分子。當載體與插入片段具有同樣黏性末端時，插入片段以相等的比例形成插入方向相反的兩種重組分子。如果用產生不相同末端的兩種限制酶對載體和插入片段分別作雙酶切時，插入片段就只能以一個方向與載體進行連接。
表型篩選的方法非常有效并且易于進行，當載體的克隆位點或是多聚接頭位點存在于第二個表型標記內部時即可進行表型篩選，片段插入到這些位點后通常會使標記失活。第二個標記可以是抗生素的抗性基因，例如在pBR322中的抗性基因。在這種情況下攜帶重組質粒的轉化子印影到含有第二種抗生素的平皿上便不能生長，但可以從母平皿上回收得到。
（一）限制性核酸內切酶
核酸限制性內切酶能夠專一識別DNA雙鏈上某堿基順序（圖4-1）。我們知道如果設計單位點酶切，質粒DNA與PCR擴增產物都會產生兩個相同的粘性突出末端的線狀分子，通過連接，就會產生不同方向性連接的重組質粒，也就產生了另一個問題，不同方向性的連接產生的結果一樣嗎？為了避免這個問題，所以我們的實驗設計了兩個位點酶切，保證了連接的單向性。
核酶限制性內切酶作用于底物DNA時，受到許多要素的制約：
（1）底物DNA樣品的純度：在制備DNA樣品中，由于各種條件的影響，存在著一些非DNA物質，這些物質有的對酶切反應影響較大，如抽提過程中，有機物質的殘留成份，如酚、氯仿、酒精，都會破壞酶的活性，另外未除去的蛋白質，也會干擾酶的反應，殘留的染色體DNA則會相對降低酶對底物DNA的濃度。
（2）離子濃度：限制性核酸內切酶專一性需要鎂離子，以作為輔基。并且要求一定的鹽離子濃度，在使用上，通常把限制性核酸內切酶對鹽離子的要求分為三類，即高鹽、中鹽和低鹽，它們所需的Na+分別為100mmol/L、50mmol/L和10mmol/L。如果離子濃度使用不當，酶反應不完全或會使酶的識別位點發生改變，例如高鹽類的EcoRI酶當Na+離子濃度低于50mmol/L時，它的專一性就降低。只能識別中間的4個核苷酸序列（此活性記為EcoRI*）由于EcoRI酶切反應需要高鹽緩沖液，在中鹽緩沖液中反應比較慢，HindIII酶切反應需要中鹽緩沖液，實驗要求EcoRI與HindIII酶同時消化DNA時，而酶切反應要完全，則選用了中鹽緩沖液。中鹽緩沖液雖然對EcoRI酶的效果有一些影響，但總體上還是可行的。還有一種方法就是先用中鹽緩沖液的HindIII酶切，再用高鹽緩沖液的EcoRI酶切，效果可以更好。但課堂實驗受時間約束，所以選用了雙酶切。
（3）底物DNA的量：商品限制性內切酶以酶單位計算，一個酶單位的定義是，即在規定的溫度和緩沖液內，于20μL反應液內1h完全消化1μgDNA所需要的酶量。所以若是底物DNA的量超過酶的酶單位所規定的消化量，則反應不能完全。不過商品酶多是濃溶液，每μL含10單位以上，價格昂貴，所以使用時要盡量節省。
（4）酶反應溫度與酶反應終止：大部分限制性核酸內切酶最適的反應溫度在37℃，極個別在60℃，所以酶反應后要使酶的活性失活時，可把反應液置于65℃內保溫10-15min，以終止酶反應，但此法對個別酶（最適溫度在60℃的酶）不適合。
（5）酶反應時間：酶消化時間通常依酶的濃度，底物的濃度和純度而定，通常是30min到2h，甚至更長些，但不能過長。因為商品酶極有可能含有雜酶，時間過久，微量的雜酶的酶反應也會積累到干擾整個酶反應的程度。
（二）連接反應的原理
在體外用EcoRI與HindIII兩種酶切載體質粒DNA與PCR產物，均產生了兩種不同的粘性末端，這些相同的粘性末端之間可以由氫鍵相連接，但在兩個氫鍵相連的片段之間5′磷酸和3′羥基未能連上，仍有缺口，本實驗通過T4
DNA連接酶（圖4-2）反應，把這些缺口以共價鍵連接起來，構成完整的嵌合質粒。
T4
DNA連接酶是由T4噬菌體DNA編碼的酶，可以連接雙鏈分子中3′羥基和5′磷酸，補上其缺口。它的作用步驟如下：
（1）T4
DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶-AMP復合物（腺苷酰酶）。
（2）酶-AMP復合物再結合到具有5′-磷酸基和3′-羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化。
（3）產生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來。
影響T4DNA連接酶的主要因素有以下：
（1）連接酶的用量
在一般情況下，酶的用量大，濃度高，反應速度快，反應連接物多，若所使的連接酶濃度太稀，要加進大量的連接酶。而商品連接酶是保存在50%甘油中，因此連接反應液中加入的酶量太大，則反應系統甘油含量過高，反而抑制酶的活性，影響連接效果，特別是含有雜酶的連接酶，加入量越大，影響就更大。
（2）作用時間和溫度
T4
DNA連接酶的最適溫度是37℃，但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結合不穩定。EcoR I與Hind
III酶所產生的粘性末端，只通過四個堿基對相結合，這不足以抵抗該溫度下的熱運動，因此在實驗操作時，DNA分子粘性末端的連接反應，其最適溫度是采取催化反應與末端粘合反應溫度的折中，一般采用12-15℃，反應時間為一晝夜。也可采取4-5℃，反應時間為一個星期，同樣也得到良好的效果。
（3）底物的濃度問題
一般采用提高DNA的濃度來增加重組DNA分子的比例，DNA濃度太稀，質粒自連比率將會上升。當底物濃度過高時，連接效果也很差，這可能是分子運動受到阻撓。載體DNA和外源基因的比例也要合適，否則將會降低重組分子的機率。
（4）其它干擾因素
反應液中殘余微量物質也可能干擾酶反應，例如，EDTA的存在會抑制酶的活性。DNA樣品中如有蛋白質，RNA存在，也會妨礙連接酶與DNA的直接作用。所以反應時，所用的器皿和試劑都應是干凈的和高純度。
（三）感受態細胞的制備
所謂感受態，是指細菌生長過程中的某一階段的培養物，只有某一生長階段中的細菌才能作為轉化的受體，能接受外源DNA而不將其降解的生理狀態。感受態形成后，細胞生理會發生改變，出現各種蛋白質和酶，負責供體DNA的結合和加工等。細胞表面正電荷增加，通透性增加，形成能接受外來的DNA分子的受體位點等。為了把外源DNA（重組質粒）引入大腸桿菌，就必須先制備能吸收外來DNA分子的感受態細胞。在細菌中，能發生感受態細胞是占極少數。而且，細菌的感受態是在短暫時間內發生。
近來，在許多研究室都發現CaCl2對受體菌處理，可提高轉化效率幾十倍，通常把細胞懸浮在pH6.0的100mmol/L
CaCl2（圖4-3）中，在冰浴條件下，放置過夜，轉化率轉高，但一過24h，轉化率測恢復為原來的水平。
（四）重組子的轉化
我們已經制備好大腸桿菌感受態細胞，接下的實驗是把重組的DNA引入受體細胞，使受體菌具有新的遺傳特性，并從中選出轉化子。作為受體的大腸桿菌C600或DH5α，必須不同外來DNA分子發生遺傳重組，通常是rec基因缺陷型的突變體，同時它們必須是限制系統缺陷或限制與修飾系統均缺陷的菌株。這樣外來的DNA分子不會受其限制酶的降解。保持外來DNA分子在受體細胞中的穩定性。制備的大腸桿菌細胞就具有這三種缺陷（r-km-krec-）同時此受體細胞還是氨芐青霉素敏感（Amp）。在體外構建好的重組分子上具有分解氨芐青霉素（Amp）基因存在，當它導入受體細胞后，就賦于這些受體細胞新的特性，即Amp抗性。同時載體質粒上具有乳糖操縱的β-半乳糖苷酶基因（lacZ），我們可以利用外源基因插入載體β-半乳糖苷酶基因，使其失去β-半乳糖苷酶活性的原理來選擇新構建的重組子。
把外來重組分子和感受態細胞在低溫下混合，使其進入受體細胞。DNA分子轉化的原理較復雜：吸附——完整的雙鏈DNA分子吸附在受體菌表面；轉入——雙鏈DNA分子解鏈，單鏈DNA分子進入受體菌，另一鏈降解；自穩——外源質粒DNA分子在細胞內又復制成雙鏈環狀DNA；表達——供體基因隨同復制子同時復制，并被轉錄和翻譯。
對DNA分子來說，能被轉化進受體細胞的比率極低，通常只占DNA分子的0.01%，改變條件，提高轉化率是很有可能的，一些研究表明下列因素可以提高轉化率：（1）受體菌細胞與DNA分子兩者比例在1.6×108細胞：1mg
DNA分子（4.3Kb）左右轉化率較好；（2）DNA分子與細胞混合時間為1h最佳；（3）鋪平板條件會影響轉化率；（4）對不同轉化菌株熱處理（效應不一致）。
除上述因素外，轉化試驗還注意如下問題：
（1）連接DNA反應液與受體細胞混合時，一定保持在冰浴條件下操作，如果溫度時高時低，轉化效率將極差。
（2）熱處理2min后，要迅速加進1mL
LB以使表型表達，延遲加LB，將使轉化率迅速降低。
（3）在平板上涂布細菌時，注意避免反復來回涂布，因為感受態細菌的細胞壁有了變化，過多的機械壓涂布將會使細胞破裂。影響轉化率。
（五）藍白班篩選
目前實驗使用的許多載體都具有一段大腸桿菌β-半乳糖苷酶的啟動子及其編碼α肽鏈的DNA序列，此結構稱為lacZ基因。lacZ基因編碼的α肽鏈與失去正常氨基末端的β半乳糖苷酶突變體互補，產生具有功能活性的β-半乳糖苷酶分子，這種現象稱為α互補。在IPTG（異丙基硫代β-D-半乳糖苷）的誘導下，β-半乳糖苷酶能將X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和藍色的底物5-溴-4-靛藍。因此，任何攜帶lacZ基因的質粒載體轉化到β-半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細胞后，都會在涂有IPTG和X-gal的培養基平板上形成藍色菌落。當有外源DNA片段插入到位于lacZ中的多克隆位點后，就破壞了α肽鏈的閱讀框，從而無法形成α互補，不能產生具有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有外源DNA片段的重組子的克隆在涂有IPTG和X-gal的培養基平板上是白色菌落（圖4-4）。