Transwell法的步驟:
先把小室擦干凈后在超凈工作臺照紫外過夜。如新的小室省略此步。下一步將小室倒扣并小室的底部外側滴加0.1%(還是1%記不清了)的明膠室溫放置20-30分鐘。這是將細胞消化下來,調濃度。拿出24孔板加600ml的含有刺激因子的培養基。小室上還未干的明膠甩掉,加細胞放入24孔板里。放入細胞培養箱培養4-6小室。拿出小室甩掉里邊的培養基。小心擦盡小室里邊的細胞(不能碰外邊)。將小室放入裝有600ml結晶紫的24孔板染色1小時。移到空的24孔板后即可在顯微鏡下觀察了。
細胞遷移實驗步驟(Neuroprobe的使用方法)
1.膜預處理
將48.5ml H2O +1.5ml 醋酸+150μL 鼠尾膠原置于50ml的離心管。在膜的粗糙面用鉛筆做標記,放入上述溶液中4度過夜。
實驗前將膜取出,放入裝有PBS的培養皿中漂洗一遍,再用饑餓培養基洗一遍,吸去培養基后加入新的饑餓培養基,放入37度培養箱中。
2. 處理細胞
將細胞消化,調濃度1×105個/ml,細胞遷移裝置下層加入166μl含有刺激因子的饑餓培養基。小心鋪好膜(粗面朝下),裝好塑料墊,固定上層裝置。上層加入100μl細胞懸液,遷移4-6h。
3. 固定
小心將膜取下來,在用PBS弄濕的濾紙上掛掉光滑面的細胞,在新的濾紙上粗面朝上放置,徹底晾干。然后再甲醇里粗面朝上固定5min,徹底晾干。
4. 染色
粗面朝下置于結晶紫染液中30min,取出膜用雙蒸水漂洗一遍,粗面朝上放在載玻片上,數細胞。
這個方法比transwell方便。與boyden chemper法類似。