朊病毒病的確診需依賴腦組織的病理檢查，因此生前診斷較為困難。
1.流行病學資料
進食過瘋牛病可疑動物來源的食品，接受過來自可能感染朊病毒供體的器官移植或可能被朊病毒污染的電極植入手術，使用過器官來源的人體激素以及有朊病毒病家族史，均有助本病診斷。
2.臨床表現
雖然朊病毒病大多都表現為漸進性的癡呆，共濟失調及肌陣攣等：但不同的朊病毒病也有各自的一些特點，如散發性克-雅病發病年齡較大，多先有癡呆后有共濟失調，而新變異型克-雅病發病年齡較輕；庫魯病震顫顯著，往往先有共濟失調后出現癡呆；杰茨曼-斯脫司勒-史菌克綜合征多僅有共濟失調等小腦受損表現，少見癡呆；致死性家族性失眠癥以進行性加重的頑固失眠為特征。
3.實驗室檢查
腦組織的海綿樣病理改變及PrPsc陽性的免疫學檢測于確診本病有重要意義：腦脊液中的腦蛋白14-3-3及腦電圖PSWCs具輔助診斷價值，PRNP序列堿基突變的遺傳學分析則有助家族性朊病毒病的診斷。