適用
本試劑盒適用于水產品中孔雀綠的定量檢測。
原理
本試劑盒原理是競爭酶聯免疫檢測方法，利用萃取劑從樣品中提取到孔雀石綠.
在固相載體微孔板中加入標準和處理的樣品，然后加入孔雀石綠抗體，反應30分洗孔，然后加入HRP標記的孔雀石綠孵育30分后洗板，洗滌后加入顯色劑，結合的酶將無色的顯色劑轉化為藍色的產物；加入反應終止液后使顏色由藍色變為黃色；在450nm波長進行檢測，樣品中的孔雀石綠濃度與吸收光強度成反比
。
特異性
與孔雀石綠類似物的交叉反應
Compound %
CR
Malachite green 孔雀綠
100%
Leucomalachite 隱色孔雀綠
1%
Crystal Violet 結晶紫
120%
Leucocrystal Violet 隱色結晶紫
2%
檢測限
水產品: 0.5 ppb
試劑盒組成
96孔酶標板：1塊（8×12條）。 標準品貯備液（Standard）: 1瓶（0.4ml/瓶），100ppb。
酶標記物：1瓶（25倍, 0.8ml）HRP標記的孔雀石綠結合物
孔雀石綠抗體：1瓶（9ml）
底物顯色液：1瓶（16ml）
終止液：1瓶（12ml 、1N HCl）。
結合物稀釋液：1瓶（15ml）。
樣本稀釋緩沖液：2瓶（25ml）
濃縮洗滌液：1瓶（5倍， 100ml/瓶）、酶標板的洗滌。
使用說明書
注意
不要使用過了有效日期的孔雀石綠檢測試劑盒，不同批次、不同試劑盒之間的試劑等內容不可混用。不使用被污染和稀釋的試劑。使用前將所有的試劑拿到室溫（20℃-28℃），但不要超出24小時。孔雀石綠是抗生素應小心對待。終止液為1M的鹽酸避免接觸皮膚，如果不小心滴到皮膚上要馬上用水清洗。洗液是5乘的在使用時要稀釋。
還需設備
?
去離子水或重蒸水
?
100ml或更大的量筒
?
樣品提取和采集用的玻璃器皿
?
甲醇
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25、50、100 和250μL 單道或多道移液器
?
計時器
?
旋渦混合器
?
洗瓶
?
吸水紙
?
離心機
?
450nm 濾光片的酶標儀
樣品制備(肉 1:20 稀釋)
1 魚蝦去皮取肉，用勻漿器均質樣品，稱取5g均質好的樣品置于離心管中2 加入10 mL乙腈，振蕩器震蕩30分
3 4000g離心10分鐘
4 輕輕倒出上清, 移入到另一個離心管。
5 用3ml乙腈活化氧化鋁柱（1-2滴/秒）。
6 取3ml樣品過柱。
7 收集樣品于一干凈試管中。
8 加入3ml乙腈洗柱并收集與上述步驟7試管中。
9 利用樣品稀釋液1：10的比例稀釋洗脫物（50ul+450ul），待用。
第二種前處理方法： (1:10 稀釋)
1. 樣品均質后稱取4g于離心管中；
2. 加入5ml 0.2MHCL，充分混合5min；室溫2000g離心5min
3. 吸取2.5ml上清液，加入5ml二氯甲烷 ，充分振蕩2分鐘；
4. 室溫2000g離心5min，去除上層液體；
5. 轉移2.5ml下層液體于另外一只玻璃試管中，50-60℃氮流蒸發；
6. 殘留物溶于2ml乙腈，搖勻；
7. 用樣品稀釋液將混合洗出液稀釋10倍（50ul乙腈提取液+450ul樣品稀釋液）；
8. 移取75ul進行分析。
酶交聯物制備
試劑盒提供的酶交聯物是25倍的，每次使用前都要稀釋。
標準稀釋液的制備
乙腈和樣品稀釋液1:9的比例混合使用
標準的制備
標準品濃度（ppb）
標準品稀釋液（ml）
標準品
1
4
40 uL
0.5
1
1.0ml 1ppb的標準液
0.1
1.8
0.2ml 1ppb的標準液
0.05
1
1ml 1ppb的標準液
0.025
0.5
0.5ml 0.05ppb的標準液
0.01
0.8
0.2ml 0.05ppb的標準液
0
1.000
0
操作步驟
1. 使用前將試劑盒和樣品處理物提前從冰箱中拿出來使其達到室溫。裝有洗液的洗瓶。
2．從鋁箔袋中拿出要求數量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。
3. 用移液器吸取75 μl 樣品處理物到對應的測試孔 ，同時在每個孔中都加入75 μl 抗體溶液。
4. 輕輕震動30秒使其混勻孵育30分。
5. 孵育完成后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板緩沖液清洗微孔。每孔每次至少加入250ul，微震蕩洗滌后倒掉，重復三次，總共四次洗板。拍板，去掉殘留的洗液。
6. 每個孔加入150 μL 酶標結合物.
7. 輕輕震動30秒使其混勻孵育30分
8. 孵育完成后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板緩沖液清洗微孔。每孔每次至少加入250ul，微震蕩洗滌后倒掉，重復三次，總共四次洗板。拍板，去掉殘留的洗液。
9. 每個孔加入150 μL 底物.孵育30分
10. 每孔加入 100 μL 終止液.
11. 450nm 下讀取每個孔的吸光度值（OD）
結果分析
1．
半定量結果的判定，可根據樣品的吸光度值與標準的吸光度值來判定，樣品的吸光度值低于某個標準的吸光度值，則說明樣品的孔雀石綠含量大于此標準的濃度，樣品的吸光度值高于某個標準的吸光度值，則說明樣品的孔雀石綠含量小于此標準的濃度。
2．
定量結果判定，需要以標準的吸光度值為X軸，標準濃度的對數為Y軸繪制曲線圖，將標準濃度吸光度值的點用直線連接，樣品的吸光度值也位于這條直線上，根據樣品的吸光度值在Y軸上即可找到相應樣品的濃度，如果樣品的吸光度值大于最小標準的吸光度值或小于最大標準的吸光度值，即可說明此樣品中孔雀石綠的含量小于0.01ppb或大于1ppb。
3. 當樣品的濃度高于1ppb 時要調節稀釋倍數來獲得最終的濃度。