完全基因剔除轉基因動物

實驗概要

本文介紹了完全基因剔除轉基因動物的方法。完全基因剔除(entirely knock-out)：又稱基因敲除、基因打靶，指應用一段與胚胎干細胞染色體上的一段序列具有高度同源性的外源DNA，通過同源重組直接將靶基因在動物個體中的活性完全消除，來觀察靶基因失活、不表達的情況下會對動物個體產生哪些影響。

實驗步驟

1. 基因剔除的技術路線

2. ES細胞
   1) ES細胞在合適的體外培養條件下，可使細胞保持分化的全能性。
   2) 已建立了非常完善的篩選體系，很容易獲得同源重組的細胞群體。

3. 構建打靶載體
   1) 置換型載體
基本元件包括：與靶位點兩側同源的同源序列臂、正選擇標記基因、細菌質粒序列和載體上同源臂外側的線性化位點。
   2) 插入型載體
主要元件包括：打靶位點的同源序列(至少含有一個惟一的限制性內切酶位點，可用作線性化位點)、正選擇標記框及細菌質粒的骨架。
   3) 選擇性標記基因
      a. Hprt基因：
編碼次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶可以將核苷類似物代謝成對細胞有毒性的物質，基因剔除后的細胞可以在含有核苷類似物的培養基上存活。
      b. 正-負選擇系統(positive-negative selection，PNS)載體：
正選擇標記基因neo，被插入到靶基因功能最關鍵的外顯子中，或通過同源重組刪除靶基因最重要的功能域，以使靶基因徹底失活。
胸腺嘧啶激酶(HSVtk)基因作為負選擇標記基因插入到同源序列的一側。HSVtk基因產物以核苷酸類似物(FIAU，GANC)為底物，將其代謝成對細胞有毒性的物質，使細胞被殺死。
   4) 囊胚注射獲得嵌合體小鼠
      a. 將發生同源重組的ES細胞注射到胚腔中，或采用ES細胞與細胞期胚胎聚合的方法獲得嵌合體胚胎。
      b. 將嵌合體胚胎移植到同期發情的假孕母體子宮內,發育成一個嵌合體。
      c. ES細胞所攜帶的靶基因要遺傳，ES細胞必須整合到嵌合體的生殖細胞中去。
      d. 再連續的向背景品系逐代回交8-10代后，將兩個帶有單拷貝基因剔除的雜合體鼠互交，就可以獲得雙拷貝純合體的基因剔除小鼠。

附    件   (共1個附件,占27KB)

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