宏基因組學：查明微生物身份新手段

　　背景

　　《美國醫學會雜志》(JAMA)近期刊發了一篇題為《利用不需培養的宏基因組學測序技術研究產志賀毒素大腸桿菌O104∶H4暴發株》的研究論文，引起了學界和社會的廣泛關注。這篇論文中應用了一種稱為“宏基因組學”的技術方法，不通過培養，直接從病人樣品中檢測分析其攜帶的病原微生物，甚至可以發現用常規方法難以檢出的病原菌。由此，大家都開始關注一個共同的話題，是不是已經找到了一個能夠解決突發傳染病疫情病原鑒定的金剛鉆呢?是不是我們以后再也不會像面對當年SARS疫情那樣手足無措呢?

　　病原檢測技術的尷尬

　　眾所周知，人類肌體發生感染，其根本原因都是被病原微生物侵入了人體器官或組織，直接或者間接造成對人體的傷害。世界上到底有多少種微生物，目前沒有人能夠明確這個數字。

　　人類對于微生物的認識與研究主要是建立在純培養基礎上，然而研究發現通過純培養方法估計的環境微生物多樣性不及總量的1%。對于臨床常規的細菌鑒定，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌等，傳統的實驗室培養方法是可靠的，但傳統的培養方法也有一定局限性。比如，有相當比例的病原菌是不可以培養的;再如，在2011年德國產志賀毒素大腸桿菌(STEC)O104∶H4暴發感染時，由于這是一個既往沒有報道過的新的亞型，沒有相應的診斷試劑可供進行臨床檢驗，這就使得該菌的鑒定非常困難。

　　現有的常規檢測手段只能針對已知的病原微生物，對于未知病原，只能依靠一個長期、煩瑣、嚴格的流程來進行判定。

　　隨著基因組學的發展，科學家發現，絕大多數微生物都以核酸(DNA或RNA)作為遺傳物質，而且微生物的基因也具有其明確的種屬特征，因此對核酸進行檢測分析逐漸成為了微生物檢測的金標準。在這一基礎上，科研人員開始嘗試利用宏基組學來檢測微生物。

　　宏基因組學的潛力

　　宏基因組學(metagenomics)最早是在1998年由 Handelsman 等提出的，意思是指生境中全部微生物基因組的總和。宏基因組學研究的工作流程一般可以概括成，樣品采集、核酸提取、大規模測序、數據比對檢索分析、生物學功能分析等。

　　整個工作流程中，并沒有對真正的研究對象(目標微生物)進行分離、純化和培養富集，換言之，這一研究手段并不在乎樣品中有何種微生物，也不在乎有多少，而是只要在樣品中，就統統把核酸序列測定出來，然后再通過和已有的核酸序列數據進行比對，判斷已知種類和對未知種類進行預測。

　　這樣的研究方法摒棄了此前對微生物的分析手段中對于可培養性的依賴。 利用這一研究手段，可以不用采取成功率和效率低下的培養方法，就能獲知病原的種類，對于感染性疾病的預防、控制、診療和預后都具有莫大的潛力。

　　宏基因組學的瓶頸

　　幾乎任何感染性疾病的診療，最關鍵的環節之一是明確病因。常規的檢測技術包括定量PCR技術、基因芯片技術、酶聯免疫技術、細菌生化檢測技術，以及細菌培養技術等。這些技術面臨著檢測目標單一、耗時長、操作復雜、需多種技術相互印證、只能針對已知目標等缺陷，當遇到危急狀況或暴發性新突發疫情時，現有技術手段就很難滿足時效性和精確性的要求。

　　宏基因組學技術則能夠滿足這樣的需求，應用這一技術可以一次性發現所有病原的存在狀況，同時直接通過核酸序列進行判別，具有其他技術不可比擬的準確性優勢。如果能夠將這樣的診斷手段應用于臨床實踐，將極大提高對病原微生物的判明效率和準確率，以利于具有針對性的指導治療。

　　然而，這一技術的應用還面臨著靈敏度、檢測速度、操作性和經濟性的瓶頸。宏基因組學研究中最麻煩的一點就是干擾數據的比例過高問題，80%~90%的數據都是相對無用的，相當于大海撈針，需要從海量數據中挖掘少得可憐的有效數據。同時，整個分析過程包括了樣品處理、核酸提取、建測序文庫、高通量測序、數據分析等環節，檢測速度和操作性目前還無法向基層應用進行普及，高通量測序的成本雖然已大幅降低，但仍然難以進入普通醫療市場。

　　利用不需培養的宏基因組學測序技術研究產志賀毒素大腸桿菌O104∶H4暴發株

　　病菌菌株的鑒別對于流行性疾病暴發的控制至關重要。然而，傳統的基于細菌培養的診斷方式卻困難重重，特別是當不存在爆發毒株的特異性診斷檢驗方式時更是如此。宏基因組學方法從多種微生物混雜樣品中提取DNA直接用于測序，被認為是一種不需要實驗室培養即可完成爆發菌株鑒定的無限制臨床檢驗平臺。為了探索宏基因組學的潛在價值，英國伯明翰大學微生物感染研究所的Loman NJ博士等人進行了深入研究，他們發現在某一腹瀉性疾病爆發時，宏基因組學具有作為無限制的、獨立于培養的、用來識別和描述細菌性病原體特征方法的潛力。所面臨的挑戰包括加速及簡化工作流程、降低成本及提高診斷的敏感性，而所有這些可能轉而依賴于基因測序技術的改善。相關論文發表于國際權威雜志JAMA 2013年4月最新一期在線版。

　　在該項回顧性研究中，研究者選擇了2011年德國產志賀毒素大腸桿菌(STEC) O104:H4毒株流行時的45例腹瀉患者糞便樣本并進行了分析。樣本經3期分析后送交進行高通量測序(2012年8月至9月)。1期分析中，研究者利用從頭測序方法得到了流行菌株的基因組草圖。2期分析中，研究人員鑒別了每個樣本中爆發菌株基因組覆蓋的深度。3期分析中，每個樣本的測序結果都與其他未知菌株作比較，以鑒定出那些屬于非流行菌株的病原菌。主要結局為以基因組測序數據的覆蓋率進行糞便樣本中流行菌株的鑒定和特征描記。

　　結果顯示，在1期分析中，得到了STEC流行菌株的基因組草圖。2期分析中，研究人員以大于10倍的覆蓋范圍從10個樣本中找到了該爆發菌株的基因組，并在26個樣本中以大于1倍的覆蓋范圍找到了該爆發菌株的基因組。研究人員在40例STEC-陽性的樣品中發現有27例(67%)含有來自志賀毒素基因的序列。在3期分析中，研究人員找到了難辨梭狀芽孢桿菌、空腸彎曲菌、簡明彎曲菌及腸道沙門氏菌的基因序列。

　　該研究用宏基因組學(對從復雜的微生物樣品中提取的DNA進行直接測序)對2011年德國產志賀毒素型大腸桿菌爆發所做的分析中，研究人員成功地對一個疾病爆發菌株的基因組序列進行了重建;這些結果表明用這種方法具有比基于細菌培養的方法更快識別并描述細菌性病原體特征的潛力。

　　研究人員最終得出結論，在某一腹瀉性疾病爆發時，宏基因組學具有作為無限制的、獨立于培養的用來識別和描述細菌性病原體特征方法的潛力。所面臨的挑戰包括加速及簡化工作流程、降低成本及提高診斷的敏感性，而所有這些可能轉而依賴于基因測序技術的改善。