定位候選克隆包括三個基本步驟：基因組定位、候選cDNA的獲得、全長及功能分析。本文即對此策略的發展和應用作一概要介紹。
基因組定位
新發展起來的，尤其在分離腫瘤易感基因中常用的方法是用PCR方法檢測多樣本的雜合性丟失(LOH)或純合性丟失的高發頻率區，從而獲得疾病候選基因定位。體細胞抑癌基因的失活是導致癌變的一個主要因素，最常見的表現即雜合性缺失。通常在染色體上雜合性缺失的高發頻率區含有一個或多個抑癌基因。利用散布于各條染色體上的分子標記(包括STS、微衛星標記等)，用PCR檢測多個腫瘤樣本的染色體各區帶的缺失情況，可確定LOH的高發頻率區，也即確定了相關腫瘤生長負調控因子的染色體定位，并可精確到基因組分子標記指示的區域，進一步可作基因的克隆工作。利用這一方法已成功地克隆了幾個抑癌基因，如乳腺癌中的BRCA1、BRCA2及胰腺癌中的DPC4基因等。同時，FISH技術的不斷發展及推廣應用，染色體顯微切割技術的成熟，可在顯微鏡下切割特定的染色體區帶，制備染色體區帶特異探針，對正常和病變組織作FISH分析，比較確定疾病相關基因的染色體區帶定位。近些年來，RH譜(radiationhybridmap)的建立，使染色體精細定位成為可能。這些方法比原先連鎖分析的檢測速度更快、精確度更高。例如L-CTsui用連鎖分析花費了大約10年的時間才把囊性纖維變性基因定位在7號染色體，而現在可能只要一年或更短的時間就可完成這項工作。
候選cDNA的獲得
基因組定位提供的信息包含一定的分子標記，可用PCR或雜交的方法直接從YAC(yeastartificialchromosome)庫，或從BAC(bacterialartificialchromosome)庫、PAC(P1artificialchromosome)庫中篩選相對應的克隆。YAC庫的嵌合性嚴重且操作難度較大，已逐步為PAC庫和BAC庫取代。PAC系統是以噬菌體P1為基礎的克隆系統，它可容納70～100kb的插入片段，并可選擇性地區分重組子和非重組子，且同時有兩套復制機制。單拷貝復制子可用于穩定克隆增殖，而多拷貝復制子則可在Lac操縱子的控制下用于DNA的制備。BAC系統是基于大腸桿菌中可大容量容納基因且穩定性良好的F因子衍生而來的載體系統，可容納超過100kb的插入片段，BAC克隆的插入片段的平均長度為120kb，最大可達到240kb左右。良好的穩定性和操作的簡便性是BAC系統的主要優點。由這些克隆入手，采用依賴于適當cDNA文庫的方法、依賴于特征序列的方法或依賴于表達性質等方法獲得候選cDNA。
全長及功能分析
獲得了眾多的候選cDNA后，通過篩選cDNA文庫或RACE等方法克隆全長基因。為確定其中的致病基因，需要逐個檢測它們在患病家系中的變化情況，并分析其功能。功能分析往往是定位克隆中的一個難點，因為不同的疾病有不同的特征，也就需要用不同的功能檢測系統進行分析。常用的如細胞水平的正義或反義基因的表達后細胞形態和功能變化的研究，在腫瘤研究中檢測細胞形態和接觸抑制的變化，軟瓊脂生長能力的變化及裸鼠致瘤性分析等。更進一步的功能分析則包括個體水平的基因敲除實驗等。
現在還發展出了一些與其它方法相結合的新思路，如與差減雜交相結合，篩選位于候選區域的差異表達基因，大大提高了獲得有價值基因的可能性。同時人類基因組計劃中轉錄圖譜〔15〕工作的開展，有很多EST已被精確定位于染色體的不同區帶上，可以直接進行功能研究。隨著研究的深入，越來越多的EST定位工作的完成，基因轉錄圖譜的不斷完善，我們完全可以直接跳過定位克隆的第二個步驟而直接進入功能鑒定和基因全長的克隆工作，這可能將是定位克隆中最快的方法。在分析分離手段不斷提高，人類基因組計劃緊鑼密鼓地實施的今天，各種新思路新方法層出不窮，定位克隆方法的周期也將不斷縮小，為人類最終克隆各種疾病基因提供了可能性。