定點突變技術――從單點突變到多點突變

體外定點突變技術是研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系的有力工具，也是我們在實驗室中改造/優化基因常用的手段。蛋白質的結構決定其功能，二者之間的關系是蛋白質組 研究的重點之一。

對某個已知基因的特定堿基進行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構，對突變基因的表達產物進行研究有助于我們了解蛋白質結構和功能的關系，探討蛋白質的結構/結構域。

而利用定點突變技術改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的綠色熒光蛋白（wtGFP）是在紫外光激發下能夠發出微弱的綠色熒光，經過對其發光結構域的特定氨基酸定點改造，現在的GFP能在可見光的波長范圍被激發（吸收區紅移），而且發光強度比原來強上百倍，甚至還出現了黃色熒光蛋白，藍色熒光蛋白等等。

（1）應用領域

定點突變技術的潛在應用領域很廣，比如研究蛋白質相互作用位點的結構、改造酶的不同活性或者動力學特性，改造啟動子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是穩定性、活性、研究蛋白的晶體結構，以及藥物研發、基因治療等等方面。

對于單點突變，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不錯的選擇，通過巧妙設計，將質粒定點突變技術變得簡單有效。準備突變的質粒必須是從常規E.coli中經純化試劑盒(Miniprep)或者氯化銫純化抽提的質粒。

設計一對包含突變位點的引物（正、反向），和模版質粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循環延伸”，(所謂的循環延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端終止，再經過反復加熱褪火延伸的循環，這個反應區別于滾環擴增，不會形成多個串聯拷貝。)正反向引物的延伸產物退火后配對成為帶缺刻的開環質粒。

DpnI酶切延伸產物，由于原來的模版質粒來源于常規大腸桿菌，是經dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎（DpnI識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質粒中都會出現，而且不止一次），而體外合成的帶突變序列的質粒由于沒有甲基化而不被切開，因此在隨后的轉化中得以成功轉化，即可得到突變質粒的克隆 。

這個試劑盒非常巧妙的利用甲基化的模版質粒對DpnI敏感而合成的突變質粒對DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版質粒，得到突變質粒，使得操作簡單有效。

另外由于Pfu聚合酶是公認的最好的高保真聚合酶之一，堪稱高保真聚合酶的“黃金標準”，是Stratagene的看家之寶，能夠有效避免延伸過程中不需要的錯配。試劑盒采用的是低次數的循環延伸而非PCR，有助于減少無意錯配。只需要一次酶切和轉化，實驗可以在一天完成。這個試劑盒適用于質粒大小不超過8Kb的質粒。

QuikChange XL site-directed mutagenesis kit則是針對大于8Kb的質粒的定點突變的，通過優化試劑特別是其感受態細胞（XL10-Gold），使得較大的質粒的定點突變也一樣簡單。QuikChange由于操作簡單快速，效率高（>80%）而受到普遍歡迎，光是今年的前9個月就有超過400篇發表的論文中用到這個產品。

（2）產品介紹

定點突變的比較有特色的產品還有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，需要根據準備突變的質粒自行設計兩條引物（同一方向，對同一單鏈模版），一條包含計劃定點突變的序列，另一條引物包含質粒上某一個單酶切位點，不過在單酶切位點中引入突變，這樣兩條引物除了所包含的突變位點，其他序列和質粒上對應位置的序列完全一致，退火后和質粒模版結合，通過T4 DNA聚合酶延伸，延伸反應持續直到碰到另一條引物停止，兩段包含突變位點的延伸產物經T4連接成環，和模版鏈組成雜和環，帶有兩處錯配。

單酶切反應產物，直接轉化Ecoli BMH 71-18 mutS(錯配修復缺陷株)。原來的雙鏈質粒模版被切開而不能轉化，而雜和質粒由于一條鏈上單酶切位點引入突變而不被切開，保持環狀質粒得以轉化。轉化子的雜和雙鏈在E.coli的復制過程中分開，再經過一輪提質粒、單酶切、轉化，最后得到純和的突變質粒。這個試劑盒則是利用改造單酶切位點使得新合成的突變質粒不被切開從而除去原來的模版質粒。雖然這個試劑盒比上一個麻煩，但實際上是引入了兩個定點突變。只不過一個用于酶切除掉模版的反應。

（3）多位點定點突變

有的時候研究可能需要多個位點的定點突變，比如改造酶的活性或者動力學特性，研究蛋白之間的相互作用位點等，單點突變不能滿足實驗的需要，重復進行單點突變也非常浪費時間。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。

最多一次實驗可以引入5個定點突變。這個試劑盒的原理和Clontech的相似，就是準備多個帶突變的引物（同方向，對同一單鏈模版），退火后全部突變引物（不超過5個）都結合在同一環狀單鏈模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一個引物就停止，各片斷經連接成環，和單鏈模版組成雜和環，DpnI消化雙鏈模版，也消化雜和環中的模版，只留下新合成的帶多個突變的單鏈環（mutant ssDNA），得以轉化E.coli，形成雙鏈質粒。

資料表明，引入3個定點突變的效率為60%，5個定點突變的效率為30%。得到的其他質粒是帶有較少定點突變的質粒，以引入3個定點突變為例，就是有40% 左右的轉化質粒是帶有1―2個不同定點突變的質粒（因為存在1―2個引物結合模版延伸形成單鏈環的可能）。這樣，一次實驗可以得到不同數目突變的質粒，對于研究蛋白質結構和功能的關系也是有用的。

不同于定點突變的是基于PCR的隨機突變，通過改變PCR條件提高PCR過程中的隨機出錯，這種方法適用于未知的蛋白質，作全局性分析，所以有人稱為飽和突變（saturation mutagenesis）。

不過這種方法由于沒有目的性，分析操作相當繁瑣，并且不會出現一個位點2個以上堿基突變，因而應用上有局限性。定點突變適用于蛋白結構已有初步了解的基因，比PCR隨機突變更有目的性，也更為精確，簡單，同時改造基因更加“隨心所欲”。由于定點突變技術在蛋白質組 學中有這非常廣泛的應用前景，相信這個技術在不遠的將來還會有更大的改進和發展，也必將為更多人熟悉應用。