校準應在無通風的房間，移液器和空氣溫度在20℃-25℃之間，相對濕度必需在55％以上。特別是當移液量在50ul以下其空氣濕度應越高越好以減少蒸發損失的影響。
在萬分之一級別天平上放置一個小三角燒瓶，用待標定的移液器吸取蒸餾水（隔夜存放）加入小三角燒瓶內底部，每次稱重后計量，去皮重后再加蒸餾水，連續加蒸餾水 10次。加蒸餾水的量根據待標定的移液器不同規格而不同，見下表。移液器10次標定稱量在所要求的重量范圍之內為合格移液器；不合格移液器需要進行調整。移液器標定合格后，填寫自校記錄。
移液器規格 標定使用蒸餾水量 要求重量范圍
0.5-10ul 2ul 1.75-2.25mg
5-40ul 10ul 9.8-10.2mg
40-200ul 70ul 69.4-70.6mg
200-1000ul 300ul 298.0-302.0mg
1- 5ml 2000ul 1990.0-2010.0mg
2- 10ml 3500ul 3485.0-3515.0mg