然而PRM 的分析通量不如SRM。PRM 能同時監測最多10 ~15 個母離子,而SRM 能同時監測上百個離子對,因為高分辨質譜的有效掃描速度通常只有10 ~15 Hz,遠慢于SRM 的有效掃描速度。但是這一問題正逐步得到解決,多重累積(Multiplexing, MSX)技術的發展和使用有效提高了PRM 的分析通量。多重累積利用Orbitrap 前端的C 型阱(C-trap),不同質量的母離子依次被四極桿選擇并儲存于C-trap 中,等待Orbitrap 完成上次掃描后,C-trap 中儲存的混合離子同時注入到Orbitrap 中進行掃描,實現最多10 個目標物的同時監測,分析通量最高可提升10 倍[45] 。Gallien 等[46] 將多重累積與PRM 結合建立MSX-PRM 技術,利用4 重累積和保留時間分段(1. 5 ~2. 5 min 窗口),在60 min 液相梯度下,定量監測了酵母全蛋白裂解液中770 個目標肽段,對應436 種蛋白。其中,同一保留時間下的肽段數量最高達60 個,在這種情況下,循環時間保持在2 s 以下,分析通量達到SRM 的水平。此外,通過優化分辨率、離子注入時間等參數,目標肽段分析通量還能進一步提高:在MSX 設為8 時,同時監測的肽段數量可達128 個[42,45] 。
綜上所述,高分辨PRM 和MSX-PRM 技術的出現,解決了傳統SRM 技術在定量蛋白質組學方面存在的諸多不足,為復雜樣本中目標蛋白的驗證和絕對定量提供了有效手段。
4數據非依賴性采集進展:基于Orbitrap 的多種全新DIA 技術
基于數據依賴性采集(Data dependent acquisition, DDA)的鳥槍法(Shotgun)是蛋白質組學的經典策略,也是蛋白質組學相對定量的主要技術手段。DDA 二級采集取決于一級掃描結果,易造成低豐度肽段的丟失,具有一定的隨機性,掃描點數也不均勻。而SRM 等目標采集方法不能采集非目標肽段,而且分析通量有限。近年來發展的數據非依賴性采集(Data independent acquisition, DIA)結合了DDA 與SRM 的特點,將整個掃描范圍等分為若干窗口,每個窗口依次選擇、碎裂,采集窗口內所有母離子的全部子離子信息。DIA 無需指定目標肽段,通量無上限,掃描點數均勻,利用譜圖庫即可實現定性確證和定量離子篩選,同時數據可以回溯,相比傳統DDA 和SRM 具有明顯優勢[47] 。
Venable 等[48] 使用線性離子阱(LTQ),以10 m / z 窗口步長依次選擇、碎裂、采集,對15 N 標記的酵母全蛋白樣品進行相對定量分析,開創了DIA 應用的先河。結果表明,通過DIA 提取的色譜峰,其信噪比、重現性和定量準確性均明顯優于DDA,蛋白定量數量增加了87%。Gillet 等[49] 基于Q-TOF (Trip-leTOF),采用32 個連續的m / z 25 窗口建立SWATH 技術,并證明SWATH 的選擇性與SRM 相當。SWATH 的發展使DIA 越來越多地應用于定量蛋白質組學[50 ~52] 。同時,基于Q-Orbitrap (Q Exactive)的DIA 技術,同樣使用25 m / z 步長,通過更高的分辨率,使復雜樣本定量的選擇性進一步提高。此外,諸如MSE、AIF 等質量范圍不分段的DIA 方法在蛋白定量中也有所應用,但由于這些方法不進行質量分段選擇,而是將所有離子同時碎裂、檢測,基質干擾較為嚴重,難以勝任復雜樣本的定量分析[49,53] 。
然而,由于掃描速度的限制,基于高分辨質譜的DIA 通常需要以m / z 25 的大窗口步長分段,以確保獲得足夠的掃描點數進行定量。而m / z 25 的選擇窗口仍然會引入較多的干擾離子,影響DIA 的定量分析效果(圖6A)[54] 。
近來,全新DIA 技術的發展使DIA 的選擇窗口不斷縮小,DIA 定量選擇性、靈敏度和重現性進一步提高。其中,前文提到的多重累積技術已應用到DIA 中,Egertson 等[54] 利用Q-Orbitrap 的多重累積功能發展了MSX-DIA 技術,隨機將5 個m / z 4 窗口依次選擇、累積,然后同時注入Orbitrap 進行掃描。MSX-DIA 總步長仍然是m / z 20,不影響掃描速度,而m / z 20 由5 段獨立的窗口組成,實際選擇窗口僅m / z 4(圖6A)。數據利用Skyline 軟件去卷積,即可將每個碎片歸屬到特定窗口中,實現m / z 4 窗口的選擇性(圖6B)。MSX-DIA 的選擇性已接近DDA,最大程度減少了共流出肽段和雜質的干擾。Q-OT-qIT 三合一質譜技術的出現為提高DIA 性能帶來了更多可能[55] 。利用Q-OT-qIT 中Orbitrap和線性離子阱互不干擾、平行工作的特點,使Orbitrap 專門進行一級掃描,線性離子阱專門進行二級DIA 掃描,線性離子阱掃描速度達20 Hz,比高分辨掃描更快。然后,使用一級超高分辨譜圖進行母離子色譜峰的精確提取和定量,二級譜圖只用于確證、不用于定量。因此,整體掃描速度明顯增加,同時二級DIA 掃描又無需關注掃描點數,為進一步縮小選擇窗口帶來可能。WiSIM-DIA 和Full MS-DIA 正是基于這種模式建立的DIA 技術(圖7)[56,57] 。WiSIM-DIA 將m / z 200 寬窗口一級選擇離子監測掃描(Wide i-solation window-SIM)與m / z 12 窗口步長的二級離子阱全掃描相結合,24 萬分辨率的寬窗口SIM 掃描有效提高了母離子的選擇性,利用母離子精確質量提取色譜峰進行定量,相比經典DIA 的子離子定量靈敏度更高(圖7A)。同時,利用二級譜圖實現肽段定性確證。雖然與經典DIA 相比,WiSIM-DIA 二級為低分辨譜圖,但選擇窗口從m / z 25 縮小到了m / z 12,能有效減少基質背景的干擾。更進一步,Full MS-DIA 以m / z 3 步長進行二級采集,并插入若干24 萬分辨率的一級全掃描保證母離子掃描點數,與WiSIM-DIA 一樣,利用一級母離子定量、二級子離子定性(圖7B)。值得注意的是,Full MS-DIA 將選擇窗口縮小到僅m / z 3,其選擇性與DDA 相當,數據可以直接作為低分辨譜圖(母離子依1. 5 Da 質量精度)進行數據庫檢索,鑒定結果與DDA 高度吻合,首次使DIA 擺脫了依賴于譜圖庫的局限,初步實現了DIA與DDA 的統一[57] 。當然,DIA 數據直接進行數據庫檢索的算法和卡值方法也已出現,很快就會應用到DIA 中,從而使DIA 和DDA 一樣可以直接搜庫鑒定,徹底擺脫譜圖庫的限制,已有數據證明DIA 能夠獲得比DDA 更多的鑒定結果。
圖6DIA 與MSX-DIA 原理[54] :(A) DIA 與MSX-DIA 采集原理與比較; (B) MSX-DIA 譜圖通過去卷積歸屬獲得4 m / z 窗口譜圖
Fig. 6Schematic elucidation of data independent acquisition (DIA) and multiplexing-data independent acquisition (MSX-DIA)[54] : (A) Comparison of DIA and MSX-DIA; (B) Deconvolution of MSX-DIA spectra for 4 m / z selectivity
此外,最近發展的pSMART 技術,利用m / z 5 步長進行二級Orbitrap 掃描,并在掃描范圍內插入若干一級超高分辨Orbitrap 掃描,在Q-Orbitrap 平臺上實現了類似WiSIM-DIA 的采集技術[58] 。結果顯示,無論是定性還是定量分析,pSMART 的靈敏度、選擇性和重現性都要明顯優于傳統DIA。