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  • 發布時間:2020-09-01 10:13 原文鏈接: 定量PCR技術基本原理和方法以及PCR產物的檢測與定量3

    1) 特異性捕獲檢測法(非探針雜交捕獲)
    本法是非特異性檢測PCR產物的一種方法,用生物素標記引物和地高辛標記duTP或用生物素和地高辛分別標記其引物。經PCR擴增后,PCR產物中同時摻入了生物素和地高辛。用生物素包被孔捕獲PCR產物,用酶(AKP)標抗地高辛和產物反應,加底物顯色進行定量,此法是非序列特異性檢測,顯色來自所有的擴增產物。本法僅應用于非常特別的PCR擴增產物檢測。
    (2) 特異性探針捕獲檢測法
    由于PCR產物中存在非特異性擴增成分存在,用特異性探針能夠特異性檢測其PCR產物,提高方法特異性。本法就是固相捕獲、探針雜交相結合的一種特異性 PCR產物檢測方法,基本原理是用固相捕獲分子和進行檢測標記物分別位于不同核苷酸鏈上,通過核苷酸鏈相互雜交,靶兩標記物結合在一起,其余方法同非特異性捕獲法。根據其固相捕獲的方式不同,又分為固相捕獲探針法、固相擴增產物法,前者就是通過生物素和親和素系統把特異性探針結合在固相上(即固相化探針),與預先標記的PCR產物進行雜交,然后一系列反應后進行定量檢測。而后者就是生物素標記的PCR產物通過與預先包被在微孔板上親和素反應而進行捕獲,與地高辛標記探針雜交,標記抗地高辛抗體反應,加底物顯色后呈色而進行定量檢測。
    3. HPLC檢測法
    本法為非特異性PCR產物檢測法,PCR產物直接上2.5μm離子交換柱分離后,用紫外檢測器進行檢測。本法靈敏度可達fg水平,還可以用于長度不同的內標物檢測,而且初始模板數和 PCR產物峰面積之間具有良好的線性關系。
    (二) 實時檢測法
    實時檢測法就是在PCR擴增的每一個循環后分別檢測其PCR產量,借助計算機數據處理,可以描繪出PCR擴增循環過程中PCR產物變化曲線。根據PCR 變化曲線計算出未標靶基因分子數。由于實時檢測,克服終點法檢測過程中“平臺效應”對結果的影響;實時檢測仍然存在反應管之間和標本之間的擴增效率(Ev)的微小差異,導致結果的很大差異,故最好應用內標法進行較正。為了實現單管內進行實時檢測的目的,就必須使探針上標記物(指示物)在雜交或游離狀態存在發光強度差異,從而達到實時定量檢測的目的。目前該技術主要有:
    1、Taqman熒光定時定量PCR
    本法是由PE公司建立的定時定量PCR技術,本系統采用了兩端標記了熒光素(5’端熒光發光基團[R]-FAM(6-羧基熒光素)和3’端熒光猝滅基團[Q]-TETRA(6-四甲基羅達明))的寡核苷酸探針,稱為Taqman探針,Taqman PCR方法的原理是上述Taqman探針上兩個熒光物質間可能發生能量轉移現象,即應用Xnm的光(發光基團[R]的激發波長)照射[R]使其激發,發出波長X’nm的熒光,激發猝滅基團[Q],其發出波長為Ynm的熒光,也就是發光基團[R]所發出的光能一部分被用于激發猝滅基團[Q]使其發光,當 PCR反應開始后,Taqman探針與擴增鏈雜交,當新鏈延伸到Taq酶探針雜交位置時,Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切酶特性沿5’-3’方向切除方向上的障礙物-探針而進一步延長,使Taqman 5’端發光基團[R]游離出來,能量轉移現象終止,檢測到[R]發出的熒光,其熒光強度與PCR產物量成正比。Taqman技術優點有a、不需開蓋檢測,PCR擴增過程中實施實時分析,不需要PCR結束后的分析步驟,減少污染。b 在常規PCR擴增過程中,用探針對產物進行檢測,可獲得較高的檢出精度。
    2. LightCycler雙探針技術
    LightCycler 雙探針技術是Roche公司新近開發的一種PCR定量技術,該技術的特點是將熒光分子和淬滅分子分別標記在兩個不同的探針上,產生發光探針和淬滅探針,發光探針的5’端連接熒光分子;淬滅探針的3’端連接熒光分子。由于兩探針設計時可與模板同一條鏈相鄰的序列雜交,雜交時兩探針的熒光分子和淬滅分于便緊密相鄰,從而發生能量傳遞而使熒光淬滅。熒光淬滅的程度與起始模板的量成正比,以此可以進行PCR定量分析。該方法的特點是淬滅效率高,但由于兩個探針結合于模板上因此影響擴增效率,此外由于需要合成兩個較長的探針,因此合成成本相對較高

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