定量PCR

定量PCR（即時聚合酶鏈鎖反應，Real-time Polymerase Chain Reaction，簡稱 Real-time PCR、即時PCR），又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應（Quantitative real time polymerase chain reaction，簡稱 Q-PCR/qPCR/rt-qPCR、定量即時PCR、即時定量PCR），是一種在DNA擴增反應中，以螢光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反應（PCR）循環后產物總量的方法技術。

限制性內切核酸酶 反轉錄酶 熱穩定 DNA 聚合酶 dCTP 靶核酸

擴增緩沖液 dNTP 貯存液 胎盤 RNase 抑制劑

瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 屏蔽型槍頭 離心管 正向排液式移液器 PCR 儀

一、材料

1. 緩沖液與溶液

10X 擴增緩沖液

4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)

MgCl₂ ( 50 mmol/L)

胎盤 RNase 抑制劑（20 單位/ul）

2. 酶與緩沖液

合適的限制性內切核酸酶

反轉錄酶（100~200 單位/ul）

熱穩定 DNA 聚合酶

3. 放射性物質

[α-³²P] dCTP（放射性比活度：3000 Ci/mmol) 的濃度為 10 mCi/mI

4. 凝膠

瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠

5. 核苷酸與寡核苷酸

外加已知含量的參考分子（DNA 或 RNA )

正向引物（20 umol/L）與反向引物（20 umol/L）溶于水

靶核酸

6. 專用設備

自動微量移液器的屏蔽型槍頭

離心管（0.5 ml，薄壁擴增反應專用離心管）

正向排液式移液器

PCR 儀

二、方法

參考模板的制備

1. 應用本方案引言中設計與制備參考模板的方針來設計與制備適合于本項任務的參考模板。要盡可能仔細地測定參考模板的濃度，最好用熒光劑來測定。另一種方法是進行凝膠電泳和溴化乙錠（EB ) 染色后估算參考模板的含量。

2. 用水作一 10 倍稀釋系列，參考模板濃度從 10^-6 至 10^-12 mol/L。在步驟 3 應用這些稀釋液后，應將這些稀釋液在使用后放置在 -70℃ 保存，以備步驟 8 使用。切記用水而不是用 TE 作溶劑，已防止改變 PCR 中鎂離子的濃度。

cDNA 樣品的制備

3. 如果起始分子是 RNA，對于這種靶 RNA 分子在 75℃ 溫育 5 min，使其變性，隨后將樣品管插入冰水中加速冷卻。然后，在 0.5 ml 離心管中立即建立系列的反轉錄反應，反應液中含有呈一定梯度的參考模板。在這些系列反應管的每一支管內加如下試劑：

10X 擴增緩沖液                           2 ul
20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液       1 ul
20 umol/L 反義引物                     2.5 ul 
約 20 單位/ul 胎盤 RNase 抑制劑    1 ul
50 mmol/L MgCl₂                        1 ul
變性靶 RNA                                10 pg~1.0 ug
100~200 單位/ul 反轉錄酶            1 ul
10 倍稀釋的參考模板                   1 ul
H₂O 補足至                                20 ul
轉錄酶發揮作用需要 MgCl₂。

反應管在 37℃ 水浴上溫育 60 min；然后將樣品管加熱至 95℃，放置 20 min，使反轉錄酶變性滅活。

靶核酸分子與參考分子的擴增

4. 用 0.5 ml 滅菌離心管、擴增管或滅菌微量滴定板，將步驟 3 中建立的系列反應管的每一只管內依次加入如下試劑，建立擴增反應：

反轉錄反應（步驟 3）祥品或靶 DNA 樣品      5 ul
20 umol/L 正義引物                                  1.5 ul
20 umol/L 反義引物                                   1.25 ul
10X 擴增緩沖液                                         5 ul
[α-³²P] dCTP（3000 Ci/mmol）                  10 uCi
20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液                      1 ul
Taq DNA 聚合酶                                        2 單位
H₂O 補足至                                              50 ul

5. 如果 PCR 儀沒有配制加熱蓋，在反應混合液的上層應加入一滴礦物油（約 50 ul），防止樣品在 PCR 反應多個加熱與冷卻的循環過程中蒸發。另一種可選擇的方法是，如果應用熱啟動 PCR 程序，在反應混合液的上層加一滴石蠟油。放置離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。

6. 按以下方法進行 PCR 擴增。典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：




PCR 產物的檢測和定量

目前已有許多種方法能應用于 PCR 擴增產物的檢測和定量。這些方法包括固相分析，陰離子交換高效液相色譜法（HPLC) 和擴增核酸分子的熒光標記法（Reischl and Kochamvski 1995)。然而，這些如此深奧的專門化技術既不能廣泛應用也無嚴格的必要性。應用基于凝膠電泳的更加標準化的一些方法也能夠獲得精確的結果，譬如，應用熒光標記引物，在對擴增產物用全自動 DNA 序列分析進行定量分析（Porcher et al.1992), 熒光計，計算機凝膠圖像分析系統，其中凝膠用溴化乙錠或其他螯合染劑染色（Schneeberger et al. 1995; Tsai and Wiltbank 19%)，或者在 PCR 擴增過程中跟蹤測量其放射性活度。

7. 分析和測定擴增產物

(1) 在應用的參考模板分子與靶序列之間存在大小差異的時候

① 從每只反應管中抽取 20 ul 樣品，應用凝膠電泳和放射自顯影分析擴增產物的大小。

② 從凝膠中回收參考模板和靶序列的擴增電泳條帶，并用液體閃爍計數僅測定每條帶的放射性活度。可選擇的方法是，用合適的檢測儀對電泳凝膠進行掃描分析 [ 如 Ambis 掃描儀或者磷光成像儀（phosphorimager)]

③ 計算每一 PCR 反應中兩種放射性標記 DNA 的相對含量。

(2) 在所有參考模板中含用一個新的限制性酶切位點或缺失一個天然存在的酶切位點的時候

① 在擴增反應末輪循環結束后，在 94℃ 將樣品加熱 5 min。

② 使樣品冷卻至室溫，再從各管中取 20 ul 反應液并用適當限制性內切核酸酶進行消化。

③ 用凝膠電泳和放射自顯影分析擴增片段大小。

④ 從凝膠中回收參考模板和靶序列的擴增電泳條帶，并用液體閃爍計數儀測定每條帶的放射性活度。可供選擇的方法是，用合適的檢測儀對電泳凝膠進行掃描分析 ( 如 Ambis 掃描儀或者磷光成像儀)。

⑤ 計算每一 PCR 反應中兩種放射性標記 DNA 的相對含量。

8. 根據測定結果，確定可與靶序列擴增產物幾乎相等的參考模板濃度。設立另一擴增反應系列（參見步驟 4)，進一步縮小參考模板的濃度范圍。除常規成分外，這一系列反應還應包括：稀釋度連續遞增的參考模板（1:10，2:10，3:10，4:10 等)。

9. 重復步驟 5, 6 和 7。測定每一擴增反應中參考模板與靶序列的擴增產率之比，以該比例對每一個擴增反應中所加參考模板量作圖，從所得直線上找出相應的點（即反應中得到與靶序列完全相等量的擴增產物的參考模板量）。計算初始樣品中靶序列的濃度。

RT-qRCR影響分析可靠性關鍵點（Key point）：

1.分析結果依賴于模板的數量、質量以及合理的檢測方法設計

2.反轉錄反應的非標準化影響試驗的穩定性

3.數據分析應該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結果中會得到混淆的錯誤結果，因此通過對RT-qPCR的每一組分進行質量評價以達到最小化變異性，最大化可重復性，而且還需要沿用一個通用的數據分析的指南。對基因表達分析的標準化的需要是與人類臨床診斷分析相適應的。