定量PCR技術簡介

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸擴增的有效工具，由于其靈敏、特異、快速等優點，在醫學上已廣泛應用與病毒、細菌病原體及遺傳病、腫瘤的早期診斷。隨著PCR技術的發展，特別是病毒或腫瘤的治療監測、疾病的診斷、機體基因表達調控方面，不僅需要檢測其存在是否；而且還需要得知擴增前標本中的模板的數量，因而必須對PCR進行定量檢測，即定量PCR技術，本文將對定量PCR的定量原理、技術類型以及相關進展方面綜述如下：
一、  定量PCR的基本原理：
在PCR實驗條件下（Mg++、緩沖液、Taq酶、dNTP、引物、模板），經變性→退火→延伸的一個循環，引物在退火階段與相應的模板結合，在延伸階段進行復制，此時產物為：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n個PCR循環后PCR產物的分子數；Yn-1:為n-1個熱循環后PCR產物的分子數；Ev:為擴增效率,0≤Ev≤1；若n個熱循環中其Ev是一致的話，經n個循環后的擴增產物的分子數（Y）和反應物中原始分子數（X）之間關系，可描述為：Y=x×(1+ Ev)n。
1. 終點法定量原理：
在最佳實驗、循環次數n一定、Ev相同的前提下，根據擴增產物的量可以計數出反應物中原始分子數，若核酸提取效率相同（與標準品），進而計算出標本中靶分子的準確含量，即：
lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b為常數)
2. 實時檢測法定量原理：
在最佳實驗、相同Ev以及相同擴增產物的情況下，反應物中原始分子數（X）與其所需要的擴增循環次數（n）成反比，若核酸提取效率相同（與標準品），進而計算出標本中靶分子的準確含量，即：
LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b為常數)3. 擴增效率（Ev）的影響因素：
以上所述的定量原理均假定反應體系中擴增效率是不變，但是，實際上，Ev在不同的擴增管之間和同一擴增管的不同循環次數之間是不同，如何控制及解決Ev的變異以及標本制備的可靠性是PCR定量的可靠性所在，也是定量PCR的發展方向，那么，Ev的影響因素有：
a. 引物和靶序列的結合能力（G+C%及突變），擴增產物的長度，G+C含量。
b.  模板的含量、DNA聚合酶、反應液成分變化。
c.  不同臨床標本間DNA聚合酶抑制物的存在情況。
d.  循環擴增儀上不同位置的差異。
二、  定量PCR方法的分類：
目前對標本的靶DNA或基因的相對或絕對含量是不同樣品的PCR產量檢測而推算出來，根據標本中是否加入內標物，將分成以下兩種：
（一）  外標法定量PCR：
一個已知含量的標準品（通常用質粒）經一系列的稀釋后與待檢標本一起進行擴增，制作PCR擴增產物和靶核酸含量的標準曲線，根據待檢標本的擴增產物量即可推算出靶核酸的絕對含量；上述已提及不同標本間的擴增效率（Ev）的差異，對樣本間PCR產量作比較會產生很不準確的結果；以外還應考慮“平臺效應”對結果的影響，因為“平臺期”PCR產物量并不受初時模板量的影響；導致結果的準確性和重復性差，因此采用外標法應該注意：
a、  注意標準化操作，優化最佳實驗條件，減少標本間Ev的差異導致對結果的影響。
b、  標準品的稀釋因存在隨機分布而導致結果的不準確。
c、  注意“平臺效應”對實驗結果的影響。特別是后面提及的終點法檢測PCR產物的方法中。
d、  由PCR方法很靈敏，特別RT-PCR方法，沒有內標存在的情況下，標本的污染而對實驗結果產生很大的影響。
e、  標本處理對結果的影響。
（二）  內標法定量PCR：
由于上述提及的外標法存在不同標本間的Ev差異和標本的提取（特別是RT-PCR）的微小變化都將導致擴增產物的巨大差異。為了清除此種影響，國內外都推重采用內標法。內標法是用PCR技術進行準確定量的基礎和今后的發展方向，根據采用內標品的不同，又分為非競爭內標定量PCR（quantitative PCR with noncompetitive intenal standands）和競爭定量PCR（competitive quantitative PCR）
1、   非競爭內標定量PCR
從細胞類標本中提取靶基因（核酸）時，同時會提取大量與靶基因無關的DNA或RNA；可以把這些靶基因無關DNA或RNA作為內標與靶基因同步擴增，即在同樣的反應條件下，在一個反應試管內同步擴增來自同一標本的一段靶基因序列和另一段無關的內標序列，不享受同一引物和引物結合位點，內標序列擴增可校正諸如DNA含量、標本內PCR聚合酶抑制物，不同反應管間擴增效率的差異，通過比較兩種序列和內標序列的擴增產物即可對靶基因相對定量該方法目前主要用于檢測靶基因在體內的含量前后變化，用于疾病的治療檢測。這種方法應注意靶序列和內標序列的擴增效率差異和初始模板DNA含量比例關系和循環次數所導致的“平臺效應”對結果的影響。該法的主要優點是簡便（不需構建內標品操作），可以消除反應管之間差異和一定程度上消除標本間變異。
2、競爭定量PCR（competitive quantitative PCR）
競爭定量PCR是先構建一個與靶基因相同的擴增效率和引物結合位點僅探針結合位點不同的內標，在同一反應管內，靶基因和內標物和引物（primer）競爭性結合，進行同步擴增，由于競爭作用，當一種模板量逐漸增加時，另一種模板的擴增產物相對逐漸減少，但兩種擴增產物的比值和兩種初始狀態時模板分子數的比值是一致的。根據標準品的準確含量制作標準曲線，從而進行準確核酸定量。由于內標品構建中特別要求是Ev與靶基因擴增效率一致，如果靶基因序列和內標相同，那么擴增過程中兩者的實際擴增效率就接近一致，就可以對靶基因進行絕對定量，即確定樣品中靶基因準確分子數，否則只能相對定量，即確定樣本間靶基因分子數的差異，總體上說，加入內標物，消除PCR擴增過程中于反應管和反應管間以及標本之間存在差異。因此，內標法是目前PCR定量方法中最準確的方法，但構建內標物是建立本方法的關鍵。
構建內標物的基本原則是內標物具有靶基因的相同擴增條件和相同擴增效率。和可區別于靶基因探針結合位點與不干擾靶基因的擴增。因此，理想的內標物應具備與靶基因序列待分析序列相同的引物結合位點，相似的或相同大小、相似的堿基排列順序。目前，內標法構建的方法有：靶基因擴增產物的突變；限制性片段的插入或缺失；含靶基因引物結合位點的非同源性DNA序列等，其中通過PCR方法構建的探針結合位點核苷酸直接突變構建的內標物是目前應用最多、最方便的方法。
三、  PCR產物的檢測與定量
定量PCR檢測靶基因核苷酸的含量最終是通過對其PCR產物的特異性檢測和定量而推測算出來的，根據對PCR產物檢測方式不同分為終點法（Terminal detection）和實時檢測法 (real time detection).
(一)  終點檢測法(Terminal detection）
終點檢測法就是PCR擴增反應結束后，對其產物進行分析和定量檢測的一種方法，終點法檢測要特別注意“平臺效應”對實驗結果的影響。為了實現對PCR終產物的定量檢測，必須對PCR產物進行預先標志。目前標志物有：放射性同位素和非放射性標志物。放射性同位素因放射性因素而目前很少用，后者包括螺旋結構染料（如溴化乙錠等）、地高辛、生物素以及熒光素（包括普通熒光素如Fam、TRAMA和鑭系螯合物等），地高辛、生物素以及熒光素可以通過標志dNTP或引物的5’端從而摻入PCR擴增產物中，除熒光素標志產物可直接發光外，其余可與HRP或AKP標志的抗地高辛抗體或親和素反應，加入底物后產生顏色、發光或熒光信號，從而進行檢測。這些標志物進行標志的是檢測時的捕獲劑或是作為定量檢測的指示劑；根據對PCR終產物的檢測特異性不同又可分為：
1. 瓊脂電泳掃描檢