自 1994 年，第一例轉基因植物產品 Flavr Savr TM 西紅柿在美國上市，到 2003 年底，世界范圍內轉基因作物已遍布 18 個國家和地區，種植面積達 167.2 萬英畝 (6770 萬公頃 )( Ewen SWB,1999; 北國網 ) 。大量實踐使得植物轉基因技術已有了比較經典和成熟的技術路線。除了在商業領域內獲得抗性植株外，植物轉基因技術還延伸到植物生理學研究（生化反應途徑、植物抗病、抗逆性）以及生物反應器研究（藥物、疫苗等）中（ Khachatourians 2002 ）。
一般經過上游表達載體的設計構建以及下游轉化體系的建立、轉化品系的篩選鑒定等一系列步驟后，即獲得 T 0 代轉基因植物。在轉化過程中，外源 DNA 隨機插入植物基因組內，插入的拷貝數和位點都不固定。插入外源基因的拷貝數低（ 1 或 2 個）能較好的表達，插入的拷貝數多則會導致表達的不穩定甚至基因沉默現象（ Flavell 1994 ， Vaucheret et al 1998 ）。因此，檢測 T 0 代轉基因植物的外源基因的拷貝數是研究其分子特性的基礎步驟之一。
Southern blot 是一種常用的 DNA 定量的分子生物學方法。其原理是將待測的 DNA 樣品固定在固相載體（硝酸纖維膜或尼龍膜）上，與標記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的固相 DNA 的位置上顯示出雜交信號，通過檢測信號的有無、強弱可以對樣品定性、定量，從而計算出轉入的拷貝數。 Southern 法準確性高、特異性強，但存在費時費力的缺點。另外，由于 Southern 法檢測不經過靶片段的擴增（ PCR ），一般每個電泳通道需要 10-30 μ g 的 DNA ，在實際操作中就需要較大量的植物材料來提取 DNA ，而轉基因植物的愈傷組織在無菌條件下經過篩選、重新分化后一般都比較細弱，不宜大量取樣。如果外源基因在插入時發生基因重組，造成限制性酶切位點丟失， Southern 法也無法檢測到。這些因素都制約了 Southern 法在 T 0 代轉基因植物中檢測外源基因拷貝數的應用。
實時熒光定量 PCR 技術是一種較新的 DNA 定量方法。其定量的基本原理是在 PCR 反應體系中加入非特異性的熒光染料（如： SYBR GREEN I ）或特異性的熒光探針（如： Taqman 探針），實時檢測熒光量的變化，獲得不同樣品達到一定的熒光信號（閾值）時所需的循環次數： CT 值（ Cycle Threshold ）；通過將已知濃度標準品的 CT 值與其濃度的對數繪制標準曲線，就可以準確定量樣品的濃度。熒光定量 PCR 技術具有簡便、快捷的優點，能夠有效擴增低拷貝的靶片段 DNA ，對每克樣品中 20pg-10ng 的轉基因成分進行有效檢測。同時，與 Southern 法相比，熒光定量 PCR 技術可對 T-DNA 的不同序列進行擴增，因此能實現對轉基因品系中的基因重組的檢測（ Giovanna 2002 ）。
選擇一種合適的陽性標準品來繪制標準曲線，是應用實時熒光定量 PCR 技術準確定量模板初始濃度的基礎。近年來，國內外的科學家做了不同的嘗試。
P Song （ 2002 ）等人認為：理想的標準品應該是已插入外源基因的植物基因組 DNA ，并且用 Southern blot 準確測得插入的外源基因拷貝數。但是在實際研究中，很難得到這樣一套標準品。因此，他提出替代方案，根據外源基因拷貝數和野生型植物基因組 DNA 的大小，按一定濃度比率混合，制成標準曲線。例如，在轉基因玉米的外源基因拷貝數研究中他們發現：在加入熒光染料 SYBR GREEN I 的 20 μ L PCR 反應體系中，應以 6 ng 野生型玉米基因組 DNA 作為模板量。已知玉米基因組 DNA 大小為 2.5 × 10 9 bp （ Armuganathan and Earle 1999 ），相應于 6 ng 的玉米基因組 DNA ，即可計算出模擬 1 ， 2 ， 4 ， 8 ， 16 個外源基因拷貝時，應加入的質粒 DNA 的量。以這些梯度混合液作為標準品，就可繪制標準曲線，檢測樣品的濃度并計算插入的拷貝數了。實驗表明，用這種方法獲得的數據和 Southern blot 的結果相當一致。
Giovanna （ 2002 ）將農桿菌介導的轉基因番茄作為研究材料，選擇了雙元載體 T-DNA 區上的兩個外源基因： TSWV-N （ Tomato spotted wilt virus ）、 npt Ⅱ ( neomycin phosphoril-transferaseⅡ ) 和一個單拷貝的內源基因（ endogenous gene ）作為熒光定量 PCR 擴增的模板，檢測外源基因拷貝數。他認為使用植物基因組 DNA 和一定比例質粒的混合液作為標準品，會累積許多無法避免的誤差。比如使用這種標準品必需預先知道待測植物基因組 DNA 的精確分子量，并對植物基因組 DNA 和質粒準確定量，但在大多數情況下得到的數據都只是近似值，再以此混合液作為標準品檢測每一轉基因植株的外源基因拷貝數時，就會放大這些誤差。
因此，他提出"相對 CT "或" δ-δCT "的方法，這個方法的優點是不需要為每次實驗制作標準曲線，只需要一個優化步驟證明外源基因與內源基因有相同的，至少是相似的反應效率即可。使用實時熒光定量 PCR 技術先測得同一模板的目標基因和內源基因的相對比值：
R line = SQ trans /SQ end
其中 SQ trans 為樣品中外源基因（ TSWV-N 和 npt Ⅱ ）的濃度； SQ end 為樣品中內源基因（ endogenous gene ）的濃度。
C trans = （ SQ trans × V ） /M trans
C end = （ SQ end × V ） /M end
C trans ： C end = （ SQ trans /SQ end ）×（ M end / M trans ）
其中， C trans ， C end 分別為外源基因和內源基因的拷貝數； M trans 和 M end 分別為外源基因和內源基因的分子量。因為內源基因為單拷貝， SQ trans /SQ end 的比值就與外源基因的拷貝數成正比。
δR line = R line [(δ SQ trans /SQ trans ) 2 + (δ SQ end / SQ end ) 2 ] 1/2
應用以上公式可計算出 R line 的標準偏差 δR line 。
最后，還需要知道單拷貝外源基因 R line 值，與每一個體的 R line 值做比較，計算出其準確拷貝數。即使用已知是單拷貝的轉基因植株，計算出其 R lin e 作為校正參數 R cal （ calibrator ），然后將 R cal / R line 的比值作為該品系的拷貝數。可是這種方法會將 R cal 值計算過程中的得到的初始濃度的誤差不可避免的帶到以后每一個品系的計算中去，造成結果的集體偏差。為此，使用下面的公式計算出 R 1 值，即單拷貝外源基因的 R line 值來替代原先的 R cal ：
F(R 1 ) = ∑ lines [R line /R 1 -N(R line /R 1 )] 2 / (δR line ) 2
其中， N(R line /R 1 ) 是最接近 R line /R 1 的整數。經計算， npt Ⅱ 基因的 R 1 值為 0.31 ； TSWV-N 基因的 R 1 值為 0.21 。將 R 1 /R line 代入公式即可知兩個基因在該植株中的拷貝數。由于 npt Ⅱ 基因與 TSWV-N 基因都位于雙元質粒的 T-DNA 區，若是同一植株的兩個基因拷貝數不同，很可能就是在質粒整合的過程中發生了重組。 與 Southern blot 法相比，這種方法更為靈敏。
與其他檢測方法相比， Giovanna 在實驗中需要優化的條件少、誤差小，可以得到有效、可靠的數據。另外，通過同時檢測 T-DNA 上的兩個外源基因： TSWV-N 和 npt Ⅱ 的拷貝數，還可以有效評估外源基因的重組情況。
參考文獻
Ewen SWB, Pusztai A. Effect of diets containing genetically modified potatoes expressing Galanthus Nivalis lectin in rat small intestine. (1999) The Lancet 354, 1353-1354.
北國網 http://economy.lnd.com.cn/economy/ZX/200401/1518220040115.htm
Khachatourians GG, McHughen A, Scorza R . Transgenic plants and crops. ( 2002) New York (USA), Marcel Dekker .
Flavell RB : Inactivation of gene expression in plants as a consequence
of specific sequence duplication . (1994) Proc Natl Acad Sci USA , 91 ,
3490 
3496 .
Vaucheret H, Béclin C, Elmayan T, Feuerbach F, Godon C, Morel JB,
Mourrain P, Palauqui JC, Vernhetters S : Transgene-induced gene
silencing in plants ( 1998) Plant J , 16 , 651 
659 .
Giovanna Mason, Paolo Provero, Anna Maria Vaira, Gian Paolo Accotto. Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative real-time PCR. (2002) BMC Biotechnol 2 (1), 20
P Song, C Q Ca, M. Skokut, B D Kosegi, J F Petolino. Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimatingtransgene copy number in WHISKERS?-derived transgenic maize. (2002) Plant Cell Rep 20, 948–954