實時熒光定量 PCR 技術,是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個 PCR 進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量的方法。
實時定量 PCR 技術是在常規 PCR 基礎上,添加了一條標記了兩個熒光基團的探針。
一個標記在探針的5'端,稱為熒光報告基團(R);
另一個標記在探針的3'端,稱為熒光抑制基團(Q)兩者可構成能量傳遞結構,即5'端熒光基團所發出的熒光可被熒光抑制基團吸收或抑制。
當二者距離較遠時,抑制作用消失,報告基團熒光信號增強。熒光信號隨著 PCR 產物的增加而增強。
實時定量 PCR 方法就是利用此原理,在 PCR 過程中,連續不斷地檢測反應體系中熒光信號的變化。當信號增強到某一閾值(PCR 反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號,熒光閾值的缺省設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍)時,此時的循環次數(Ct 值)就被記錄下來。
該循環參數(Ct 值)和 PCR 體系中起始 DNA 量的對數值之間有嚴格的線性關系。利用陽性梯度標準品的 Ct 值,制成標準曲線,再根據樣品的 Ct值就可以準確確定起始 DNA 的數量。