實驗材料 細胞樣品
試劑、試劑盒 RNA提取試劑盒熒光定量PCR MixTRIZOLdNTP氯仿逆轉錄酶MMLV異丙醇Taq酶DEPC水ddH2OTEMgCl2瓊脂糖溴化乙錠MOPS甲醛乙酸鈉EDTAEB溴酚蘭
儀器、耗材 離心管離心機風光光度計電泳槽凝膠板Realtime PCR儀
實驗步驟
一、 樣品RNA的抽提
1. 取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
2. 兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
3. RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7 000 rpm離心5分鐘。
5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、 RNA質量檢測
1. 紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
（1）濃度測定
A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體計算如下：
RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀釋至495 μl的TE中，測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5 ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
（2）純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
2. 變性瓊脂糖凝膠電泳測定
（1）制膠
1 g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度 成分
0.4 M MOPS，pH 7.0
0.1 M 乙酸鈉
0.01 M EDTA
灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
（2）準備RNA樣品
取3 μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
（3）電泳
上樣前凝膠須預電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3 cm。
（4）紫外透射光下觀察并拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。
三、樣品cDNA合成
1. 反應體系
序號 反應物 劑量
1 逆轉錄buffer 2 μl
2 上游引物 0.2 μl
3 下游引物 0.2 μl
4 dNTP 0.1 μl
5 逆轉錄酶MMLV 0.5 μl
6 DEPC水 5 μl
7 RNA模版 2 μl
8 總體積 10 μl
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
2. 混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5 μl，37℃水浴60分鐘。
3. 取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。
四、 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR
1. β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3 μl按10倍稀釋（加水27 μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
2. 反應體系如下：
標準品反應體系
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 μl
2 陽性模板上游引物F 0.5 μl
3 陽性模板下游引物R 0.5 μl
4 dNTP 0.5 μl
5 Taq酶 1 μl
6 陽性模板DNA 5 μl
7 ddH2O 32.5 μl
8 總體積 50 μl
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
3. 管家基因反應體系：
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 μl
2 內參照上游引物F 0.5 μl
3 內參照下游引物R 0.5 μl
4 dNTP 0.5 μl
5 Taq酶 1 μl
6 待測樣品cDNA 5 μl
7 ddH2O 32.5 μl
8 總體積 50 μl
輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm短暫離心。
3. 制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環。
五、 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板
1. 針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
2. 反應體系
序號 反應物 劑量
1 10× PCR緩沖液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物F 0.5 ul
4 下游引物R 0.5 ul
5 dNTP混合液 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至總體積為 25 ul
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
35個PCR循環（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。
（3）PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
（4）將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。
六、 待測樣品的待測基因實時定量PCR
1. 所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。
2. 體系配置如下：
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1 ul
3 下游引物 1 ul
4 dNTP 1 ul
5 Taq聚合酶 2 ul
6 待測樣品cDNA 5 ul
7 ddH2O 30 ul
8 總體積 50 ul
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
（3）將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃ 2分鐘預變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環，最后72℃7分鐘延伸。
七、 實時定量PCR使用引物列表
引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構；引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。
八、電泳
各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。