實時PCR的參數實驗

LUX引物 單鏈或雙鏈的 DNA 或 cDNA Mg2+ dNTP 熱啟動酶

PCR 儀

一、方法

1. 引物

實時 PCR 的引物必須具有基因的特異性，并能進行較短片段的擴增。

a.LUX 引物設計軟件（LuxDsigner) 缺省的參數已經被設定為可以擴增 75~200bp 長度的片段，引物退火溫度范圍為 60~68°C, 在設置 PCR 程序時，退火溫度為 55~64°C 比較合適。該軟件設置的參數可以使引物自身互補或引物間形成二聚體的可能降到最低。運用該軟件進行引物設計，非常靈活，設計的引物可以橫跨外顯子之間的邊緣區域或結合區域。

b. 通常 PCR 反應時，引物濃度都是過量的。用 LUX 引物進行反應時，建議引物濃度用 200nmol/L。引物濃度在 50?500nmol/L 之間時，一般會得, 到理想的結果。特別是針對看家基因進行多元擴增時，建議用有限的引物濃度，這樣會得到理想的結果。

2. 模板

實時 PCR 的模板可以是單鏈或雙鏈的 DNA, 或 cDNA, 也可用環狀 DNA(如質粒）。模板濃度通常用 10~10⁷ 拷貝或 1pg~10ug。

a. 進行實時 PCR 時，若模板是總 RNA 或 mRNA, 濃度通常用1pg~100ng。

b.RNA 的純度和完整性對結果有直接影響。

c.RNA 酶和基因組 DNA 污染是最常見的問題，對 RNA 純化時要注意這些問題。

d.RNA 酶的存在將會降解 RNA 模板，導致低估目的基因的表達豐度，而 DNA 的污染則相反。

e. 用橫跨外顯子之間結合區域的序列設計引物可以避免 DNA 污染的影響。但這種策略并不都有效，建議在對 RNA 進行純化時加入 DNaseI。

3.Mg²⁺和 dNTP 的濃度

a.1~10 mmol/L 的 Mg²⁺濃度在一定的目的基因和引物濃度前提下可獲得理想的結果，建議通常使用 3 mmol/L。逬行多元反應時，把 Mg²⁺濃度提高到 5 mmol/L。

b. 理想的 dNTP(dATP/dCTP/dGTP/dTTP) 濃度是 200umol/L。若 dUTP 替代 dTTP，dUTP 的濃度應增加到 400umol/L。進行多元反應時，把 dNTP 濃度提高到

400umol/L。

4. 酶

建議使用熱啟動酶。

a. 除了模板和引物，公司提供的 PCR 反應混合物非常方便。對實時 PCR 來說，建議使用 PlatinumQuantitativePCRSuperMix-UDG(Invitrogen，11720-025，500Reactions);一步法 RT-PCR 時，建議使用 ThermoScriptOne~Step-System(Invitrogen，11731-023，500Reactions)

b. 進行多元反應時，為了避免 PCR 效率降低，50ul 反應體系中可以加 3U 的酶。

5. 儀器設備

許多專門的設備都可進行實時 PCR, 參照用戶指導手冊進行。下面，針對 ABIPRISM7700 型號系列檢測系統的使用方法進行簡要的介紹。