實時RTPCR實驗

試劑、試劑盒 RNA 模板DNA 酶緩沖液 DNA 酶 IDEPC 處理的水oligo(dT)MgCl2 dNTPEDTA

實驗步驟

—、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

①10ul 消化體系的組分。

RNA 模板（最多 1ug/10ul)                             xul

10XDNA 酶緩沖液                                           1ul

DNA 酶 I，1U/ul(Invitrogen18068-015)           1ul

DEPC 處理的水                                              8~xul

②20ul 反轉錄體系的組分。

oligo(dT)12~180.5ug/ul                                   0.5ul

Random Hexamer50ng/ul                                 0.5ul

RNA 模板（最多 1ug)                                      xul

10X 緩沖液                                                      2ul

(20 mmol/LTris-HCl、pH8.4，500 mmol/LKCl，25 mmol/LMgCl2)

25 mmol/LMgCl2                                               4ul

10mmol/LdNTP                                                 1ul

0.1mol/L 二硫蘇糖酵（DTT)                              2ul

RNA 酶 OUT(40U/u1)1ul

SuuerscriutⅡ(50U/ul) 反轉錄系統（Invitrogen11904-018)1ul

25 mmol/LEDTA                                                 1ul

DEPC 處理的水                                                  補足到 20ul

二、方法

1.把上述的 10ul 消化體系混勻，25°C(室溫）孵育 15 min, 然后加入 25 mmol/LEDTAlul，然后 65°C 孵育 15 min，以使 DNA 酶 I 失活。

2.每次進行 RT-PCR(20ul) 時，PCR 管應放在冰上混合各種成分。逬行多個反應時除了 RNA, 可以把所有的試劑混在一起，然后分裝。反應條件：25°C 孵育10min，42°C 保持 30~50 min,70°C 再保持 15 min, 最后在冰上冷卻。

3.反轉錄完成后，最好加入 1ulRNA 酶 H,37°C 孵育 20 min 以消化剩余的 RNA。用上面所述的Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG 反轉錄得到的 cDNA, 即可用作實時 PCR 的模板，也可于-20°C 保存以備將來之用。