實質等同性（代謝組學）實驗

實驗材料：SIMCA - P 多變量統計軟件   

試劑、試劑盒：[ 1H ] - NMR 抽提劑      

儀器、耗材：

Eppendorf 聚丙稀管                                                                  

NMR 管                                                                  

NMR 波譜儀 

實驗步驟:

本章描述的方法最適合于分析小麥精白面，但改進后也適用于全面粉、麥麩或其他組織，如葉和根。在開展實質等同性代謝組學實驗前，如其他任何田間試驗或溫室試驗一樣，要考慮的關鍵步驟包括田間試驗設計（見注 1) 、組織取樣（見注 2 ) 和樣本標記（見注 3) 。

3.1 代謝物提取和 NMR 樣品準備

( 1 ) 從白面粉的每一個生物重復中，稱取 3 份 30 mg ( ± 0.03 mg ) 的樣品，分別裝入標記好的 1.5 ml  Eppendorf 管。在整個實驗中，生物重復和技術重復都要隨機化（見注 4) 。

( 2 ) 加入 1 ml NMR 抽提劑（見上述），蓋上管蓋。

( 3 ) 渦旋混勻管內內容物，直到面粉完全分散（通常大約 30 s ) ( 見注 5) 。

( 4 ) 將離心管在（50±1)℃ 準確加熱 10 min。可使用聚苯乙烯浮子和預熱的水浴鍋來完成。離心管應放置好使內容物在水浴面下。

( 5 ) 從水浴鍋中取出后，迅速將離心管轉入微型離心機離心 5 min。

( 6 ) 從每管中取 800 μl 上清液，加入到干凈的、標記好的 1.5 ml 聚丙烯管中。

( 7 ) (90±2)℃ 熱激溶液 2 min ( 見注 6 )，如前所述，使用預熱的水浴鍋。

( 8 ) 將浮子從水浴鍋取出后，迅速將離心管轉移到管架上，置于冷庫（4℃），在該溫度下放置 45 min。

( 9 ) 當樣品保持低溫時，微型離心機全速離心 5 min。

( 10 ) 取 0.70 ml 上清液加到一個干凈的標記的 5 mm 薄壁 NMR 管，加蓋準備分析 ( 見注 7) 。

3.2 NMR 數據收集

( 1 ) 將 NMR 管放入 NMR 自動采樣器架上，在儀器工作記錄本上記錄它們的位置。

( 2 ) 確認 NMR 波譜儀內可變溫度單元設置為 300 K。

( 3 ) 在自動程序的樣品列表輸入樣品細目，務必準確地輸入適當的樣品標記。對于輸入的每個樣品，選擇 D₂O 作為樣品溶劑，掃描所需數目是 1024，參數設置為 WATERSUP ( 見注 8~10) 。

( 4 ) 開始自動程序。隨后 NMR 軟件自動裝載每個樣品進入 NMR 磁體，尋找 D₂O 信號并鎖定、優化信號強度 （ 通過自動勻場程序），設置接收器增益，然后收集 NMR 數據。數據收集結束前，NMR 自動程序例行自動處理數據并保存文件，隨后繼續下一個樣品（見注 11)。

3.3 NMR 數據：肉眼檢查和質量保證

( 1 ) 在整個實驗結束后，打開 AMIX ( Analysis  of   Mixtures，Bmker  Biospin，Germany) 軟件，從 X Win NMR 指令選擇 File > Open。在彈出窗內輸入合適的存放實驗數據文件的文件位置，點擊 “OK”。

( 2 ) 在彈出框內選擇整個實驗所有樣品記錄，點擊 “OK”。

( 3 ) 所有的 NMR 圖譜此時都應在主窗口展示。檢查文件確保獲得滿意數據（ 見注 12 ) 。

( 4 ) 對步驟 3 中數據未滿意的樣本重新進行鑒定（見注 13)。

( 5 ) 當數據被收集和質量評估后（見注 14) ，從 NMR 管中取出樣品，轉移到螺帽玻璃瓶中。將這些瓶子儲存在冰箱中，以備將來分析所需。

3.4 數據處理、數據庫和光譜存儲

在分析數據包中的數據之前，還需要對數據進一步處理。在這一步驟中，包括在 Bmker  NMR 波譜數據庫中（ SBase) ( AMIX software 的一部分）對數據的準備。做這一步的緣由是為了確保數據集的高可比性，降低數據的復雜度，使 32k 數據點轉換為含有約 1k 數據點的矩陣。由于樣品 pH 的微小差異會導致某些信號中微弱化學位移差異，而 “ bucketing” 這一過程能消除位移差異所導致的數值校準問題。

( 1 ) 打開 AMIX ( Analysis   of   Mixtures，Bruker  Biospin， Germany) 軟件，選擇  AMIX Tools > Prepare  Data。

( 2 ) 在準備數據窗口，通過從 X Win NMR 指令選擇 File > Open 打開需要加入到 SBase 的文件。在彈出窗內輸入存放實驗數據文件的合適位置，點擊 “OK”。

( 3 ) 在彈出框內選擇整個實驗所有記錄，點擊 “OK”。

( 4 ) 所有的 NMR 圖譜此時都應在主窗口展示。

( 5 ) 在 80.00 處放大 d₄ -TSP 峰值。這是內標峰值。設置這一峰值為最大高度（見注 15)。

( 6 ) 重設縮放，使整個波譜寬度都能呈現。

( 7 ) 選擇批處理功能，在彈出窗口選擇以下選項：

( i ) 刪除負峰；

( ii ) 使用用戶定義范圍 810.0~10.2 減噪。

( 8 ) 輸入第 1 個樣品的樣品名（見注 16)。

( 9 ) 將這個光譜保存至光譜數據庫（SBase ) 后把它關閉，輸入列表中下一個光譜的樣品名。

( 10 ) 將所有數據保存到 SBase 后，關閉樣品準備窗口，開啟 “Buckets” 窗口 ( AMIX  Tools  > Buckets)。

( 11 ) 選擇  “Create new  bucket  table ”，在彈出窗口中選擇 “data from SBase”。

( 12 ) 會再有一個窗口彈出。定位待 bucket 數據。

( 13 ) 在 Bucketing 選項窗口選擇（見注 17)。

( i ) 待 bucketed 的數據范圍（89.5~0.5 ppm)

( ii ) Bucket 寬度（0.01 ppm)

( iii ) 包容峰（所有正峰）

( iv ) 按比例縮放法（按參考區域設定比例）

( v ) 參考區域（80.05~- 0.05)

( vi ) 排除（無）

( 14 ) 用電子數據表包如 Microsoft  Excel 打開 bucket 表。

( 15 ) 增加額外的行標簽輔助將來數據分析（如株系、處理、時間點）。

( 16 ) 去掉對應于殘留水（84.775~4.865) 和甲醇（S3.285~3.335) 的行。

( 17 ) 以 Excel 工作表形式保存文件。

3.5 多變量分析（見注 18)

( 1 ) 打開 SIMCA - P 軟件（其他類似的軟件包也可使用。具體的操作可能不同，但原理相同）。

( 2 ) 創建新項目（nie > New ) ，選擇分析文件（由上一步創建）（ 見注 19)。

( 3 ) 轉置數據集（Commands >Transpose  dataset ) , 使化學位移為列數據而樣品為行數據。

( 4 ) 突出化學位移首行，選擇該行作為主要變量 ID。

( 5 ) 突出包含樣品名的列，選擇該列作為主要觀測 ID。

( 6 ) 突出任意描述列，將這些列賦值為定性 X 數據。

( 7 ) 繼續上傳數據。一旦啟動，不要排除任何數值（見注 20 )。

( 8 ) 雙擊數據模型，選擇 “ workset” （工作集）按鈕。

( 9 ) 選擇縮放比例選項，突出所有數據，選擇縮放方法 “ ctr ”。這樣通過減去平均值使數據以零為中心。

( 10 ) 通過選擇變量選項和選定描述數值，排除 PCA  ( 主成分分析）模型中任何定性數值。排除這些條目。

( 11 ) 自動適配并檢查 PCA 模型（見注 21)。

( 12 ) 此時可以分析 PCA 得分圖（見注 22) 。不同的成分圖應該用不同的聚類模式分析。PC1 對 PC2 必須檢測，因為這些成分常常能解釋數據集當中最大的變異。

( 13 ) 根據你的描述信息（株系、處理等），利用顏色編碼變量，這樣便于觀察數據集的趨勢。

( 14 ) 對于每個得分圖，應該生成兩個對應的載荷圖（見注 23 ) 以描述導致群集差異的代謝物。

( 15 ) 載荷圖中的正負峰都能按照群集間代謝物變化賦值。這可以通過比較使用同一光譜儀在同等條件（溶劑、溫度、脈沖程序）下運行正宗的純化合物，而且采用 AMIX 在同樣條件下 bucketed 收集的 NMR 頻譜庫實現（ 見注24) 。

( 16 ) 如果沒有清晰的群集，可進行判別分析。這包括在建模前設定類別到數據集 ，以及使用該信息以“強加”數據集中的差異。相應的得分和載荷圖可以如前所述觀察（見注 25) 。

( 17 ) 在生成載荷圖的過程中，收集引起差異的數值點的信息。這只提供線索。同時也需要檢查原始數據以確認代謝物的賦值和變化。載荷圖的所有區域都應檢查到，因為某些情況下，非常小的峰的強度變化可以比頻譜中非常大的峰上的微小變化更有意義。

3.6 確定實質等同性

PCA 得分圖能夠快速評估樣品間的相似和差異程度。載荷圖用于鑒定導致差異的代謝物。目前，大多數研究 [ 2, 3 ] 認為栽培品種間的差異和環境的差異比轉基因的影響更大。然而，對于導入的代謝酶或其調節物，也應考慮導入的基因對特定代謝物的直接作用。有必要建立不同的 PCA 模型，以檢測環境對轉基因/非轉基因作物的影響。

如果去除了環境差異和品種差異后，轉基因對非轉基因的得分圖并沒有形成獨立集，在分析技術所限定的范圍內，認為轉基因與非轉基因具實質等同性。更先進的監督模型，如 PLS 或神經網絡 [ 8 ] 可用于進一步探究數據集是否有差異。