3.4 凝膠染色
為了用蛋白質組學研究 2D 膠上蛋白點，染色必須與質譜分析兼容，且靈敏度越高越 好。符合這些標準的染色法有好幾種可供使用，包括膠體考染、某些銀染和各種熒光染劑，如 Sypro Ruby、Orange、Deep Purple 和 Flamingo。膠體考染靈敏性不如銀染和熒光染料，但是便于使用且相對便宜（見注 6 關于靈敏度部分）。銀染是一種多步式的過程，但能使較低豐度蛋白顯現。然而，由于沒有終止點，高豐度蛋白 可能會過度著色。同時，銀染的重復性可能不佳，因為染色程度取決于操作者。所有染色過程都需要在振蕩器或搖床上進行，在染色/脫色過程中提供溫和的振蕩。
3.4.1 膠體考馬斯亮藍 G250
( 1 ) 在 50%（V/V）甲醇、10%（V/V）乙酸（或 TCA ) 中過夜固定凝膠。
( 2 ) 在膠體考馬斯染料中染色（按照使用說明書用甲醇稀釋）（Bio- rad；4 : 1 染料：甲醇）。
( 3 ) 用 25%（V/V）甲醇，7%（V/V）乙酸脫色 1~5 min。
( 4 ) 用 25%（V/V）甲醇脫色過夜，保存在水中。
3.4.2 銀染（參照 [ 13 ])
( 1 ) 凝膠用 40%（V/V）乙醇、10%（V/V）乙酸（或 TCA）固定 30 min。
( 2 ) 置于“敏化液” 中 30 min：30%（V/V）乙醇，0.2% (m/V) 硫代硫酸鈉 ( sodium thiosulphate ) ，0.5 mol/L 乙酸鈉。
( 3 ) 用蒸餾水洗三次，每次 5 min。
( 4 ) 加入銀溶液 [ 0.25%（m/V）硝酸銀]，染色 20 min。
( 5 ) 用蒸餾水洗兩次，每次 1 min。
( 6 ) 置于“顯影液” 中：0.24 mol/L 碳酸鈉，每升溶液加 200 μl 37% 甲醛 ( 0.0074% 終濃度）。
( 7 ) 溶液變得混濁或 10 min 后加入新鮮顯影劑。繼續顯影直到達到所要求的染色程度。
( 8 ) 加入 0.04 mol/L EDTA 10 min 終止反應。
( 9 ) 用蒸餾水洗兩次。
( 10 ) 保存在水中。
3.4.3 Sypro Ruby 蛋白染色
( 1 ) 膠用 40%（V/V）甲醇，10%（V/V）TCA 固定過夜（18 h ) 。
( 2 ) 用 Sypro Ruby 染料在暗處染色過夜。Sypro Ruby 是光敏感的，所以凝膠需要在暗室中處理，凝膠儲存盒要蓋上鋁箔。
( 3 ) 凝膠用 10%（V/V）甲醇、6%（V/V）TCA 脫色。
( 見注 7 關于 Sypro Ruby 的使用和廢液處理）
3.5 凝膠成像與分析
有不同廠商的成像系統可供使用。掃描儀必須具有高分辨率，如需進行凝膠斑點質譜分析，掃描儀還要與切點儀（spot picker) 結合。
同樣的，有許多軟件包可供使用，允許凝膠匹配，產生合成（或參照）凝膠。 斑點體積、峰高和峰面積也可通過不同程序包獲得，因而能對處理進行比較。有必要進行進一步的數據分析，如主成分分析（PCA ) ，所以膠分析程序包所得的數據必須能轉換成 Excel 數據表，并與統計軟件包兼容。
3.6 酶解前膠塊脫色 （參照 [ 14 ])
3.6.1 對于考馬斯和 Sypro Ruby 染色凝膠塊
( 1 ) 在水中浸置 15 min，棄去水，繼續在 50 : 50 的水：乙腈中再浸置 15 min。
( 2 ) 重復上述清洗步驟。
( 3 ) 倒去所有液體，用乙腈覆蓋膠塊 5 min，此時膠塊應該不透明并脫水。
( 4 ) 棄乙腈，加入 0.1 mol/L NH4CO3，使膠塊再水化，放置 5 min。
( 5 ) 加入乙腈使乙腈：NH4CO3 比例為1 : 1，孵育 15 min。
( 6 ) 棄液體，抽真空離心使之干燥。
3.6.2 對于銀染膠塊
( 1 ) 將膠塊放入“ Farmer’ s 還原劑” [20% (m/V) 硫代硫酸鈉、1% (m/V) 鐵氰化鉀與水 1 : 1 : 1 混合 ] 直到膠塊完全干凈。用水沖洗。
( 2 ) 棄液體，抽真空離心使之干燥。
3.7 還原和烷化（參照 [ 14 ])
( 1 ) 膠塊在 10 mmol/L DTT、0.1 mol/L NH4HCO3 中，56°C 浸置 45 min 使之泡脹。倒去多余液體，迅速換以 55 mmol/L 碘乙酰胺、0.1 mol/L NH4HCO3，室溫，暗處孵育 30 min。
( 2 ) 棄去碘乙酰胺溶液，用 1 : 1 乙腈：0.1 mol/L NH4HCO3 清洗膠塊 15 min。
( 3 ) 棄液體，抽真空離心使之干燥。
3.8 酶解
胰蛋白酶膠內消化（參照 [ 14 ]) :
( 1 ) 加入足量的胰蛋白酶溶液，剛好覆蓋膠塊，冰浴 45 min 使之泡脹。
( 2 ) 棄去多余液體，加人 25 mmol/L NH4HCO3/5 mmol/L CaCl2，剛好覆蓋膠塊。
( 3 ) 37℃ 溫育過夜。
( 4 ) 肽段分離：快速離心收集消化物到底部，加入最小體積 25 mmol/L NH4HCO3，室溫孵育 15 min。
( 5 ) 加入等體積乙腈，混勻，室溫下孵育 15 min。
( 6 ) 收集上清，再用 5%（V/V）甲酸：乙腈（1 : 1 ) 重復抽提兩次。
( 7 ) 合并上清，抽真空離心使之干燥。
3.9 利用 Zip Tips 為質譜分析進行多肽除鹽和濃縮
3.9.1 MALDI - MS
( 1 ) 10 μl 0.1% (V/V) TFA 重懸消化物。
( 2 ) 10 μl 50: 50 乙腈：水潤濕吸管尖，重復兩次。
( 3 ) 10 μl 0.1% ( V/V) TFA 平衡管尖，重復兩次。
( 4 ) 上下吸抽 10 次將樣品吸入管尖（將多肽吸附到 tip ) 。
( 5 ) 0.1% TFA 清洗管尖。
( 6 ) 用 4 μl 50:50 乙腈：水，0.1% TFA 洗脫。
3.9.2 ESI-MS ( 參照 [ 15 ])
( 1 ) 10 μl 含 1% (V/V) 甲酸的 4%(V/V) 甲醇重懸消化物。
( 2 ) 10 μl 1% 甲酸潤濕吸管尖，重復兩次。
( 3 ) 上下移液 10 次進行蛋白質消化。
( 4 ) 用 10 μl 0.1% (V/V)甲酸清洗管尖。
( 5 ) 用 4 μl 含 1% ( V/V ) 甲酸的 70% (V/V) 甲醇洗脫。
3.10 MALDI 靶板點樣
( 1 ) 1 μl 消化物與 1 μl 基質混合。
( 2 ) 點樣于 MALDI 靶板，室溫下風干。