3.5 cDNA 合成
( 1 ) 加 100 μg DNA 酶處理過的總 RNA ( 不超過 20 μl) 、8 μl oligo (dT)23 錨定引物和無核酸酶水至終體積 28 μl。
( 2 ) 將啟動反應混合物在 70℃ 孵育 10 min，置于冰上 5 min。
( 3 ) 向啟動反應混合物加入 cDNA 合成反應混合物：10 μl 5x 第一鏈緩沖液，10 μl 0.1 mol/L DTT，5 μl 50x aa-dNTP 混合物，2 μl Superscript 逆轉錄酶Ⅲ（ 200 U/L ) ，加無核酸酶水至終體積 50 μl。
( 4 ) 42℃ 孵育 2~3 h。
( 5 ) 用微型離心柱（Qiagen) 參照使用說明純化 aa-dUTP-dDNA 產物。
( 6 ) 收集最后的洗脫液 10 μl 作為樣品。cDNA 的產品將用于準備芯片雜交的探針和實時 RT- PCR 技術。最后反應可不用 50x aa-dNTP 混合物進行（見注 17)。
3.6 cDNA 芯片標記
( 1 ) 為了 cDNA 與突光染料偶聯反應，將需要反向染料標記的總 cDNA ( 見第3.5節步驟6 ) 分成兩等份（5 μl ) ，并將不同梁料的反應放在單獨的管。
( 2 ) 每管加入： 5 μl 氨基烯丙基純化的 cDNA ( 見 3 . 5 節步驟 3 ) ，3 μl 1 mol/L NaHCO3 標記緩沖液，2 μl ALexa 熒光染料 555 或者 647，10 ml 無核酸酶水。
( 3 ) 移液器混勻，室溫黑暗孵育 1 h。
( 4 ) 用 mini Elute columns 試劑盒（Qiagen) 去除沒有與 aa-dUTP- cDNA 偶聯的染料( 見注18)。
3.7 cDNA 芯片雜交
( 1 ) 取 20 μl 混合的標記 cDNA ( 來自 3. 6 節步驟 6 的兩個 Alexa 染料）加入到 25 μl 2x 雜交緩沖液和 2 ml poly (dA ) 。
( 2 ) 探針在 95℃ 3 min 變性。
( 3 ) 標記的探針涂在蓋片上，并將載片印有 Code Link 面朝下放置。
( 4 ) 將芯片雜交盒置于烘箱內 42℃ 過夜。
( 5 ) 將芯片置于含有溶液 A 的 Falcon 管（藍帽）中（見 2. 6 節步驟 2 ) ，室溫顛倒 15 min (見注 19)。
( 6 ) 將芯片轉移到第二個含有溶液 A 的 Falcon 管中，室溫顛倒 15 min。
( 7 ) 將芯片轉移到第三個含有溶液 B 的 Falcon 管中（ 見 2 . 6 節步驟3 ) ，室溫顛倒 15 min。
( 8 ) 將芯片轉移到第四個含有溶液 C 的 Falcon 管中（見 2 . 6 節步驟3 ) ，室溫顛倒 15 min。
( 9 ) 將芯片放置干燥的 Falcon 管中，立刻 8000 g 離心干燥。
( 10 ) 用 Axon 儀器公司的 Gene-Pix 400B 型雙激光掃描儀掃描雜交芯片。
3.8 cDNA 芯片數據分析
芯片做圖像分析，檢測每一個觀測點的兩種熒光信號的強度，以此來評估成對小麥系之間轉錄基因的表達差異。數據標準化后，作適合某個模型的統計分析，說明實驗設計 ，檢測差異表達的顯著性。
3.8.1 圖像分析和標準化
芯片上的點用 GenePix 軟件掃描成圖像（Gene Pix 第 5 版，美國 Axon 儀器公司），然后所有的點進行人工檢測，排除雜交失敗或者信號弱的。圖像分析給出了每一點的所有像素，這些數據包含了兩種熒光染料信號（647和 555 ) 的平均值和 Log2 比率值。這些數據專用于差異表達分析。將數據從 GenePix 導入 GeneSpring 軟件包 （GeneSpring 6. 2 美國硅遺傳公司），然后信號強度的 Log2 比率值進行標準化。本研究中，一個點的 Log2 比率值（差異表達的）（ M ) 和 Log2 乘積（亮度的）（ A ) 之間的比較表明，局部加權光滑描點技術（ LOWESS ) 標準化處理，可用于消除數據不佳的趨勢。換句話說,所有點的 Log2 比率值乘以 （ across ) 光 強 （ Log 乘積）應該在一個恒定范圍內，但圖像顯示有一些會隨著 A 増加而發生變化的趨勢。因此，標準化處理的目的是消除 Log2 比率數據的系統變異（ 比如由于實驗過程）。局部加權光滑描點技術（ LOWESS ) 標準化處理，是通過逐點檢測 M 和 A 值之間的關系，然后相應地調整 M 值（adjusted M = MLOWESS- fittedM) 。由于有兩個獨立的實驗， L 88-31、 L 88-18和 B 102-1-1的數據與 Cadenza的數據分開處理。
3.8.2 統計分析
參考 Kerr [ 15 ] 討論的方法，使用 GenStat 統計系統（ GenStat 第 7 版 ，GenStatProcedure Library Release PL15， Lawes Agricultural Trust, Rothamsted Research Harpenden, U K ) 分析規范化的數據（ 進一步的詳細信息見[ 5 ] 及其補充材料）。在估計基因的固定效應之前，用符合 Log2 比率的線性混合模型來估算實驗設計（ 生物學和技術重復）的隨機效應。該模型通過模型計算用數據的整體殘差（ 噪聲）估計標準誤參 數（一個基因一個參數）。每個參數對其標準誤的比率服從殘留自由度的 t 統計分布，這使得從 0 (Log2 范圍）開始的差異表達統計上顯著性得到評估。在我們的研究中，通過表達量和拷貝數篩選顯著差異表達基因（ P <0.05 )，只有那些表達差異大于 1.5 倍并且存在多 2 次以上重復的基因被保留下來做進一步分析。
3.8.3 用實時 RT-qPCR 驗證差異表達
挑選轉錄本做實時 RT- qPCR 驗證芯片表達數據，見 3.13 節。