3.4 RNA 提取
3.4.1 小麥胚乳總 RNA 提取
提取方法根據 Chang 等 [ 11 ] 改編而來。
( 1 ) 用預冷的研缽和杵（-70°C ) 在液氮里將 2~3 g 組織磨成粉末（見注 8 ) 。
( 2 ) 室溫下迅速將磨碎組織轉移到有 15 ml 提取緩沖液（加入 300 μl β-巰基乙醇 ) 的離心管中，充分顛倒混勻（ 見注9) 。
( 3 ) 用等體積氯仿：異戊醇（終體積 15 ml ) 抽提兩次，液相分離用 15000 g 室溫離心 10 min。
( 4 ) 上清液加 0.25 倍體積 10 moI/L LiCl 混勻。4℃ 過夜沉淀 RNA，4℃、15000 g，離心 20 min 獲取 RNA。
( 5 ) 500 ml SSTE 懸浮沉淀顆粒。
( 6 ) 用等體積氯仿：異戊醇抽提一次。
( 7 ) 上清液加兩倍體積乙醇，-70℃ 沉淀 30 min 以上或者 -20℃ 沉淀 2 h。
( 8 ) 15000 g 離心 20 min 沉淀 RNA。
( 9 ) 75% 乙醇洗滌。
( 10 ) 干燥沉淀并溶解于無核酸降解酶水中。
3.4.2 發芽后 8 天幼苗 RNA 提取
提取方法根據 Cheng 等 [ 12 ] 改編而來。
( 1 ) 用預冷的研缽和杵（-70℃ ) 加液氮里將已知質量組織（大約 1 g 幼葉）磨成粉末（見注9) 。
( 2 ) 將冷凍的粉末快速轉移到第二個有 10~15 ml 勻漿緩沖液的研缽中（見注10)，繼續研磨至均勻（見注 11)。
( 3 ) 勻漿液轉移到 50 ml 帶帽的圓底旋蓋離心管中，60℃ 孵育 10 min ( 勻漿液終體積 5~10 ml )。
( 4 ) 離心管置冰上冷卻，加 0.2 倍體積 pH 5.5 的 5 mol/L 乙酸鉀（見注 12) ，輕輕地充分混勻，然后冰上靜置 10~15 min。
( 5 ) 10000 g、4℃ 離心 15 min , 取上清液到新的離心管中。
( 6 ) 加等體積酚：氯仿（1 : 1，V/V ) 混勻，擰緊瓶蓋并劇烈振蕩 10 min。10000 g、21°C 離心 10 min。取上層水相于新離心管中（見注13)。
( 7 ) 水相重復上一步的酚：氯仿萃取和分層。
( 8 ) 往水相加 0~1 倍體積 3 mol/L pH 5.3 乙酸鈉和 2.5 倍體積乙醇。混勻后 -20℃ 孵育過夜以提高核酸沉淀效率。
( 9 ) 10000 g 、4℃ 離心 30 min 沉淀核酸，棄上清。倒置離心管數分鐘。
( 10 ) 少量無核酸降解酶水（ 300~700 μl ) 溶解沉淀。核酸溶液轉移到 Eppendorf 管，加 0.67 倍體積 10 mol/L 氯化鋰沉淀 RNA。拌勻，冰上孵育 20~30 min ( 見注14)。
( 11 ) 離心（15000 g，室溫，20 min ) 沉淀 RNA，棄上清。
( 12 ) 用盡可能小體積（ 200~300 μl) 的無核酸酶水溶解沉淀，重復氯化鋰沉淀，和上一步同樣離心沉淀 RNA。
(13 ) 200 μl 無核酸酶水溶解沉淀，加入 15 μl 5 mol/L 乙酸鉀（pH 5.5 ) 和 800 μl 乙醇。混勻，離心（15000 g 室溫，20 min) 沉淀 RNA ( 見注15)。
( 14 ) 棄上清，加入 1.0 ml 80% ( V/V ) 乙醇，離心洗滌 RNA ( 15000 g，室溫，10 min)。
( 15 ) 離心管開蓋置于超凈工作臺，室溫干燥沉淀不超過 10 min。溶解于 100~200 μl 無核酸酶水中。將每份樣品分成等量小份以避免在反復凍融過程中污染或者降解。
3.4.3 總 RNA 樣品除去基因組 DNA
RNA 提取之后用 DNA-free ( DNA 酶處理和清除試劑盒，Ambion) 按照使用說明處理 RNA 片段。該系統專為去除 RNA 樣品中的 DNA 雜質和清除處理后的 DNA 降解酶 I，無需加熱或苯酚提取。
3.4.4 RNA 定量分析和質量控制
RNA 濃度、完整性及質量檢測使用 Nanodrop ND 1000 分光光度計（Labtech Int ,U K ) 和 Agilent 2100 生物分析儀 ( RNA 6000 Nano Assay, Agilent Technologies, PaloAlto, CA，USA ) ( 見注 16)。
3.4.5 樣品保存
RNA 樣品短期（最長 3 個月）保存在 -20℃，長期則在 -80℃。