實驗入門第四講——PCR技術

　　一、PCR是什么

　　聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。

　　PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

　　1

　　模板 DNA 的變性：模板 DNA 經加熱至 94℃ 左右一定時間后，使模板 DNA 雙鏈或經 PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；

　　2

　　模板 DNA 與引物的退火 （復性）：模板 DNA 經加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃ 左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補序列配對結合；

　　3

　　引物的延伸：DNA 模板--引物結合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

　　重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2～4 分鐘， 2～3 小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

　　3.建立體系、上機：

　　PCR需要用到的DNA聚合酶、buffer、dNTPs。而經常用的DNA聚合酶有Taq酶，買的同時會附送10×buffer(主要成分是KCl、Tris-HCl和MgCl2，有些還有(NH4)2SO4)。做PCR之前要提醒大家一點，不是所有的PCR都用同樣的反應體系的，也就是說PCR體系里用到的試劑除了10×Taq Buffer以外，其它其實都是需要摸條件的，但是按大多數情況來說，需要調整的并不多，可能需要調整的主要試劑是MgCl2（其實是要調整Mg2+的濃度）；可能需要控制的條件主要是退火溫度，我在實驗中用到的體系如下：

　　在電泳之前，需要進行凝膠的配制，凝膠液配制的過程并不復雜，先用天平稱取適量的瓊脂糖粉末，加入到一定體積的1×TAE（Tris、乙酸、EDTA）緩沖液中，微波爐加熱至沸騰，拿出來搖勻，幫助粉末溶解，反復沸騰多次直到粉末完全溶解。待溶液不燙手，將核酸染料加入溶液中搖勻，接著將溶液趁熱倒到做膠的凝膠板上，插上梳子（用來預留加樣孔），等半小時左右膠凝固拔下梳子，連膠帶板一起放到電泳槽中，加電泳液至完全淹沒整塊凝膠（電泳槽中的電泳液也用1×TAE緩沖液）。然后將loading buffer與樣品混合，加入到凝膠小空（“梳子”形成的洞）中，DNA maker作為對照，同樣加入到篩孔中，然后插上電源開始跑膠就可以了，凝膠上有顏色的有兩條帶，等到前面的藍色帶跑到整塊膠的2/3處停止電泳（斷電），然后把膠拿出來，放到紫外光下觀察條帶。

　　四、常見的實驗設計問題

　　1、如何查找引物？

　　▲▲▲

　　引物設計/查找非常關鍵，引物的好壞很大程度上決定了PCR實驗的成功與否，引物的序列可以從文獻中查找，找到序列以后，還是要用軟件（如Primer軟件）比對一下，堿基是不是每個都正確。

　　2、退火溫度如何設置？

　　▲▲▲

　　通常情況下，可以嘗試用兩條引物中較低的Tm值減去5℃來作為退火溫度，但是這種方法有時候會不適用，在不適用的情況下可以考慮做12個退火溫度，這樣試下去，總會找到合適的退火溫度。

　　3、如何確定我設置的PCR的體系是正確的呢?

　　▲▲▲

　　做PCR的時候需要同時做個內參基因(如b-actin），因為內參基因是肯定會表達的，如果內參能做出來，證明PCR體系是沒有問題的，以此來做個質控。

　　4、凝膠制作時需要注意些什么？

　　▲▲▲

　　凝膠中一個需要注意的問題就是瓊脂糖的濃度，這部分參數是根據目的片段的大小選擇的，一般500bp以下選擇1.2%-1.5%（質量體積比）500bp-10kb可以選擇0.8%-1%，分子量再高的話瓊脂糖濃度就再低點，具體濃度可以摸一下條件。

　　五、實際的實驗過程中需要注意的問題

　　1、如何確定引物的濃度？

　　前面我們說到，引物一般交由試劑公司合成，有時候具體的濃度我們也不能確定。有些人喜歡稀釋十倍，有些人喜歡稀釋二十倍。我個人認為比較穩妥的做法是在每次拿到反轉的 cDNA 后，先會稀釋 3 倍左右，然后利用管家基因做一次 RT-PCR，循環數一般為 25 循環，鑒定一下具體濃度，再決定最后的稀釋倍數。

　　2、合成的引物是我們想要的引物嗎？

　　一般來說在拿到很多引物的時候，可以通過普通的 PCR 看看是否是單一條帶，鑒定一下引物的特異性。如果實驗室不差錢，則可以通過溶解曲線對所有的引物的特異性做一次鑒定。

　　3、操作過程中需要注意哪些問題？

　　一定要戴手套，戴手套，戴手套，重要的事情說三遍。根據經驗，少量模板的加入，容易造成加樣誤差。所以為了盡量減少加入少量模板造成的誤差，我們一般會將樣本再稀釋一倍，加樣的時候多加一倍，減少 H2O 的加入量。

　　4、你確定你的 PCR 板和儀器配套嗎？

　　如果你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 儀器，那么你一定要買配套該儀器的 qRT-PCR 板。因為不兼容的 PCR 板會導致結果偏差。這種狀況實驗小白尤其需要注意。

　　5、凝膠放入電泳槽有什么注意事項嗎？

　　凝膠放入電泳槽時一定要注意方向，核酸是帶負電的，所以電泳的方向是從負極向正極跑，因此，加樣孔一定要對著負極放置，不然樣本就跑到膠外面去了。