實驗動物標本的采集方法

實驗概要

本文介紹了實驗動物標本(腦脊液、骨髓、消化液、腹水、胸水、尿液等)的采集方法。

實驗步驟

1. 腦脊液的采集

   1)  脊髓穿刺法

狗、兔腦脊液的采集通常采取脊髓穿刺法。穿刺部位在兩髂連線中點稍下方第七腰椎間隙。動物輕度麻醉后，側臥位固定，使頭部及尾部向腰部盡量彎曲，剪去第七腰椎周圍的被毛。消毒后操作者在動物背部用左手姆、食指固定穿刺部位的皮膚，右手持腰穿刺針垂直刺入，當有落空感及動物的后肢跳動時，表明針已達椎管內(蛛網膜下腔)，抽去針芯，即見腦脊液流出。如果無腦脊液流出，可能是沒有刺破蛛網膜。輕輕調節進針方向及角度，如果腦脊液流的太快，插入針芯稍加阻塞，以免導致顱內壓突然下降而形成腦疝。

   2) 枕骨大孔直接穿刺法

大鼠腦脊液的采集可采用枕骨大孔直接穿刺法。在大鼠麻醉后，頭部固定于定向儀上。頭頸部剪毛、消毒，用手術刀沿縱軸切一縱行切口(約2cm)用剪刀鈍性分離頸部背側肌肉。為避免出血，最深層附著在骨上的肌肉用手術刀背刮開，暴露出枕骨大孔。由枕骨大孔進針直接抽取腦脊液。抽取完畢逢好外層肌肉、皮膚。刀口處可撒些磺胺藥粉，防止感染。采完腦脊液后，應注入等量的消毒生理鹽水，以保持原來腦脊髓腔的壓力。

2. 骨髓的采集

   1) 大鼠、小鼠骨髓的采集：用頸椎脫臼法處死動物，剝離出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的Hank平衡鹽溶液，沖洗出胸骨或股骨中全部骨髓液。如果是取少量的骨髓作檢查，可將胸骨或股骨剪斷，將其斷面的骨髓擠在有稀釋液的玻片上，混勻后涂片涼干即可染色檢查。

   2) 大動物骨髓的采集：狗等大動物骨髓的采集可采取活體穿刺方法。先將動物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮膚，然后估計好皮膚到骨髓的距離，把骨髓穿刺針的長度固定好。操作人員用左手把穿刺點周圍的皮膚繃緊，右手將穿刺針在穿刺點垂直刺入，穿入固定后，輕輕左右旋轉將穿刺針鉆入，當穿刺針進入骨髓腔時常有落空感。狗骨髓的采集，一般采用髂骨穿刺。

狗等大動物常用的骨髓穿刺點：胸骨：穿刺部位是胸骨體與胸骨柄連接處。肋骨：穿刺部位是第5～7肋骨各點的中點。脛骨：穿刺部位是股骨內側、靠下端的凹面處。如果穿刺采用的是肋骨，穿刺結束后要用膠布封貼穿刺孔，防止發生氣胸。

3. 消化液的采集

   1) 唾液

      a. 直接抽取法：在急性實驗中，可用吸管直接插入動物口腔或唾液腺導管抽吸唾液，此法非常簡單，但從口腔抽吸唾液會有雜質混入。

      b. 制造腮腺瘺法：在慢性實驗中，收集狗的唾液，要用外科手術方法將腮腺導管開口移向體外，即以腮腺導管為中心，切成一直徑約2～3cm的圓形粘膜片，將此粘膜片，與周圍組織分開，穿過皮膚切口引到頰外，將帶有導管開口的粘膜片與周圍的皮膚縫合，腮腺分泌的唾液就流出頰外。這種方法可以收集到較純凈的唾液。

   2) 胃液

      a. 直接收集胃液法：急性實驗時，先將動物麻醉，將插胃管經口插入胃內，在灌胃管的出口連一注射器，用此注射器可收集到胃液，此法適用于狗等大型動物。如是大鼠，需手術剖腹，從幽門端向胃內插入一塑料管，再由口腔經食道將一塑料管插入前胃，用pH7.5、35℃左右的生理鹽水，以12ml/h的流速灌胃，收集流出液，進行分析。

      b. 制備胃瘺法：在慢性實驗中，收集胃液多用胃瘺法，如全胃瘺法、巴氏小胃瘺法、海氏小胃瘺法等。制備小胃是將動物的胃分離出一小部分，縫合起來形成小胃，主胃與小胃互不相通，主胃進行正常消化，從小胃可收集到純凈的胃液。應用該法，可以待動物恢復健康后，在動物清醒狀態下反復采集胃液。

   3) 胰液和膽汁

在動物實驗中，主要是通過對胰總管和膽總管的插管而獲得胰液或膽汁。狗的胰總管開口于十二指腸降部，在緊靠腸壁處切開胰管，結扎固定并與導管相連，即可見無色的胰液流入導管。大鼠的胰管與膽管匯集于一個總管，在其入腸處插管固定，并在近肝門處結扎和另行插管，可分別收集到胰液和膽汁。有時也可通過制備胰瘺和膽囊瘺來獲得胰液和膽汁。

4. 腹水的采集

抽取狗等大動物腹水，讓狗按自然站立位固定，穿刺部位在恥骨前緣與臍之間，腹中線兩側。剪毛消毒，局部浸潤麻醉。操作者左手姆、食指緊繃穿刺部位的皮膚，右手控制穿刺深度做垂直穿刺。注意不可刺的太深，以免刺傷內臟。穿刺針進入腹腔后，腹水多時可見因腹壓高而自動流出。腹水太少可輕輕回抽，并同時稍稍轉動一下針頭，一旦有腹水流出，立即固定好針頭及注射器的位置連續抽取。

抽取大鼠、小鼠的腹水方法簡單，用左手拇指及食指捏住動物頸部皮膚，無名指、小手指及手掌夾住其尾巴固定好動物，使其腹部略朝上，在腹股溝和腹中線之間，消毒皮膚，用8號針頭刺入腹腔，如腹壓高腹水自然流出，如腹水太少，可借助注射器抽取。抽腹水時注意不可速度太快，腹水多時不要一次大量抽出，以免因腹壓突然下降導致動物出現循環功能障礙等問題。

5. 胸水的采集

收集胸水常采用穿刺法。如果實驗不要求動物繼續存活，也可用處死動物剖胸取胸水。穿刺部位在動物脊側腋后線胸壁第11～12肋間隙穿刺較安全。此部位是肺最下界之外側，既可避免損傷肺組織造成氣胸，又易采集在隔肋竇的胸水。此外，也可在腹側胸壁近胸骨左側緣第4～5肋間隙穿刺。

動物穿刺部位剪毛、消毒，操作者左手拇、食指繃緊肋間穿刺部位的皮膚，用帶夾的橡皮管套上12～14號針頭，沿肋骨前緣小心地垂直刺入。當有阻力消失或落空感時，表示已穿入胸腔。再接上針管，除去夾子，緩緩抽取胸水。如果有條件在穿刺針頭與注射器之間連一個三通管，但應注意正確運用三通管。穿刺結束迅速拔出針頭，輕揉穿刺部位，促進針孔閉合并注意消毒。

操作中嚴防空氣進入胸腔，始終保持胸腔負壓。穿刺應用手控制針頭的深度，以防穿刺過深刺傷肺臟。

6. 尿液的采集

常用的采集方法較多，一般在實驗前需給動物灌服一定量的水。

   1) 代謝籠法：此法較常用，適用于大、小鼠。將動物放在特制的籠內。動物排便時，可以通過籠子底部的大小便分離漏斗將尿液與糞便分開，達到采集尿液的目的。

由于大、小鼠尿量較少，操作中的損失和蒸發，各鼠膀胱排空不一致等原因，都可造成較大的誤差，因此一般需收集5小時以上的尿液，最后取平均值。

   2) 導尿法：常用于雄性兔、狗。動物輕度麻醉后，固定于手術臺上。由尿道插入導尿管(頂端應用液體石蠟涂抹)，可以采到沒有受到污染的尿液。

   3) 壓迫膀胱法：在實驗研究中，有時為了某種實驗目的，要求間隔一定的時間，收集一次尿液，以觀察藥物的排泄情況。動物輕度麻醉后，實驗人員用手在動物下腹部加壓，手要輕柔而有力。當加的壓力足以使動物膀胱括約肌松馳時，尿液會自動由尿道排出。此法適用于兔、狗等較大動物。

   4) 輸尿管插管法：動物麻醉后，固定于手術臺上。剪毛、消毒，于恥骨聯合上緣之上在正中線做皮膚切口(長約3～4cm)，沿腹中線切開腹壁及腹膜，找到膀胱翻出腹外。辨認清楚輸尿管進入膀胱背側的部位(膀胱三角)后，細心地分離出兩側輸尿管，分別在靠近膀胱處穿線結扎。在離此結扎點約2cm 處的輸尿管近腎段下方穿一根絲線。用眼科剪在管壁上剪一斜向腎側的小切口，分別插入充滿生理鹽水的細塑料管( 插入端剪成斜面)，用留置的線結扎固定。可見到尿滴從插管中流出( 頭幾滴是生理鹽水)，塑料管的另一端與帶刻度的容器相連或接在記滴器上，以便記錄尿量。在適用過程中應經常活動一下輸尿管插管，以防阻塞。在切口和膀胱處應蓋上溫濕的生理鹽水紗布。

   5) 膀胱插管法：腹部手術同輸尿管插管。將膀胱翻出腹外后，用絲線結扎膀胱頸部，阻斷它同尿道的通路。然后在膀胱頂部避開血管剪一小口，插入膀胱漏斗，用絲線做以荷包縫合固定。漏斗最好正對著輸尿管的入口處。注意不要緊貼膀胱后壁而堵塞輸尿管。下端接橡皮管插入帶刻度的容器內以收集尿液。

   6) 穿刺膀胱法：動物麻醉后固定于手術臺上，在恥骨聯合之上腹正中線剪毛，消毒后進行穿刺，入皮后針頭應稍改變一下角度，以避免穿刺后漏尿。

   7) 剖腹采尿法：同穿刺法做術前準備，皮膚準備范圍應大一點。剖腹暴露膀胱，操作者的左手用無齒小平鑷夾住一小部分膀胱，右手持針在小鑷夾住的膀胱部位直視穿刺抽取尿液。可避免針頭貼在膀胱壁上而抽不出尿液。

   8) 反射排尿法：適用于小鼠，因小鼠被人抓住尾巴提起時排便反射比較明顯。故需采取少量尿液時，可提起小鼠，將排出的尿液接到帶刻度的容器內。

7. 陰道內液體的采集

   1) 棉拭子法：用消毒棉拭子旋轉插入動物陰道內，然后在陰道內輕輕轉動幾下后取出，即可進行涂片鏡檢。有的適用如大、小鼠等，陰道液較少，取其陰道液時，可用先浸濕后又擠盡無菌生理鹽水的棉拭子取陰道液,這種棉拭子比干棉拭子容易插入陰道。對體型較大的實驗動物，也可先按摩或刺激其陰部，而后再采集其陰道液。

   2) 滴管法：用消毒的鈍頭滴管吸取少量的無菌生理鹽水插入動物陰道內，然后擠出生理鹽水后又吸入，反復幾次，吸取陰道沖洗液滴于玻片上制片、染色鏡檢。

   3) 刮取法：用光滑的玻璃小勺或牛角制的小刮片慢慢插入陰道內，在陰道壁輕輕刮取一點陰道內含物，進行涂片鏡檢。

8. 精液的采集

   1) 人工陰道采集精液(semen)：體型較大的動物，如狗、豬、羊等,可用一專門的人工陰道套在發情的雄性動物陰莖上，采集精液。也可將人工陰道置入雌性動物的陰道內，待動物交配完畢后，取出人工陰道采集精液。還可將人工陰道固定在雌性動物外生殖器附近，雄性動物陰莖開始插入時,立即將其陰莖移入人工陰道內，待其射精完畢后,采集人工陰道內的精液。

   2) 陰道栓采集精液：大小鼠雌雄交配后，24小時內可在雌性動物陰道口出現白色透明的陰道栓，這是雄鼠的精液和雌鼠陰道分泌液在陰道內凝固而成的，取陰道栓涂片染色可觀察到凝固的精液。

   3) 其它采集精液法：將發情的雌性動物放在雄性動物一起，當雄性動物被刺激發情后，立即將雄性動物分開，再用人工法刺激其射精。也可按摩雄性動物的生殖器或用電刺激其發情中樞或性敏感區，使其射精。