色譜柱的類型和構型(粒度、長度、內徑等)選擇通常由分離目的決定,對特定類型的色譜柱,不同的品牌之間也可能存在很大的差異。色柱要求的主要性能指標包括理も相濃度、色譜柱的穩定性等。
許多生產商為每支色譜柱提供測試色譜圖和前四項數據,有的廠家也提供同一批次或不同批次保留值重現性的數據、鍵合相濃度數據與柱穩定性數據
1.理論塔板數
塔板數(M)是色譜柱的一個基本參數,一支色譜柱的理論塔板數越高,則流出曲線的方差或峰寬越小,色譜峰越尖銳,表明色譜柱對溶質的分離能力強,即柱效高
提高色譜柱理論板數的因素包括:色譜柱填充良好、增加色譜柱長度、在最佳流速下運行、采用較小粒度固定相、采用低黏度流動相、升高色譜柱溫度、采用小分子化合物測定。
表3中給出了填充良好的各種長度與粒度不同固定相的典型HPLC色譜柱在最佳條件下的塔板數(采用小分子中性樣品,分子量約為200)。
表3 在最佳測試條件下,填充良好的HPLC色譜柱的塔板數
微粒直徑/μm | 柱長/cm | 塔板數N |
10 | 15 | 6000~7000 |
10 | 25 | 8000~10000 |
5 | 10 | 7000~9000 |
5 | 15 | 10000~12000 |
5 | 25 | 17000~20000 |
3 | 5 | 6000~7000 |
3 | 7.5 | 9000~11000 |
3 | 10 | 12000~14000 |
3 | 15 | 17000~20000 |
1.7 | 5 | 約10000 |
一般情況下,正常裝填的色譜柱對小分子樣品分離的理論塔板數可近似表示為:
式中,L為柱長,cm;dp為固定相粒徑,μm。
2.峰不對稱度
不對稱的色譜峰可能導致塔板數與分離度測定不準確、定量不準確、分離度降低與檢不出峰尾中的小峰、保留值的重現性不好等
實際工作中,通常采用峰不對稱因子As表示峰形的不對稱度或拖尾程度,理想色譜峰的As值為0.95~1.1(對稱峰As=1.0),實際分析中被測樣品的As值一般應小于1.5。
《美國藥典》、《中國藥典》等規定用色譜柱拖尾因子(T)表示色譜峰的對稱性。表4中列出了兩者的對應關系:
表4 峰不對稱因子與峰拖尾因子的關系
峰不對稱因子(10%峰高) | 1 | 1.3 | 1.6 | 1.9 | 2.2 | 2.5 |
峰拖尾因子(5%峰高) | 1 | 1.2 | 1.4 | 1.6 | 1.8 | 2 |
3.滲透性
色譜柱的滲透性可以用特定條件下的壓力降作為衡量指標。滲透性與運行條件、色譜柱尺寸和固定相粒度有關。隨色譜柱增長和固定相粒徑減小反壓升高,用不規則微粒固定相填充的色譜柱壓力可能會較高。不同品牌的固定相粒度分布范圍差別較大,因此反壓也可能有很大的差異。供應商報告的反壓一般是在特定操作條件下測試的結果。
球形固定相填充的色譜柱的壓力降可近似表示為:
式中,P為壓力降,psi(1psi-6894.76Pa);n為流動相黏度,cP
4.柱體積
不同規格的色譜柱所填充的固定相量很容易被估算,但是由于不同品牌、基質的固定相密度差別較大,估算的結果有時偏差較大。高效液相色譜柱的固定相填充體積與質量之間的近似關系在表5中給出。
表5 填充高效液相色譜柱體積計算表
OD×L/(mm×cm) | 色譜柱管總體積[π(OD/2)2L]/ml | 固定相體積/ml | 固定相質量/g |
1.0×100 | 0.086 | 0.06 | 0.07 |
1.0×150 | 0.114 | 0.08 | 0.10 |
2.1×100 | 0.343 | 0.24 | 0.29 |
2.1×150 | 0.529 | 0.37 | 0.45 |
4.6×100 | 1.657 | 1.16 | 2.11 |
4.6×150 | 2.500 | 1.75 | 2.11 |
4.6×250 | 4.143 | 2.90 | 3.50 |
7.8×300 | 14.343 | 10.04 | 12.12 |
10.0×150 | 11.786 | 8.25 | 9.96 |
10.0×250 | 19.643 | 13.75 | 16.59 |
10.0×300 | 23.557 | 16.49 | 19.90 |
21.0×250 | 86.586 | 60.61 | 73.15 |
50.0×250 | 490.871 | 343.61 | 414.69 |
色譜柱的死體積是指色譜柱中除固定相之外的體積,不同規格色譜柱的大約死體積如表6所示。對常規分析柱,內徑4.6mm、柱長150mm和250mm的色譜柱死體積分別約為1.5ml和2.5ml,當流動相線速度為1ml/min時,死時間約為1.5min和2.5min。
表6 不同規格色譜柱的死體積
色譜柱種類 | 柱長/mm | 柱內徑/mm | 大約死體積 |
納米柱 | 150 150 | 0.075 0.10 | 400ml 700ml |
毛細血管柱 | 150 150 | 0.3 0.5 | 6μl 15μl |
微徑柱 | 150 | 1.0 | 70μl |
細內徑柱 | 15 30 50 | 2.1 2.1 2.1 | 30μl 60μl 100μl |
溶劑節省柱 | 100 150 | 3.0 3.0 | 0.43ml 0.64ml |
分析柱 | 15 30 50 75 150 250 | 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 | 0.15ml 0.30ml 0.50ml 0.75ml 1.5ml 2.5ml |